Dans ce protocole, nous décrivons une méthode de collecte simultanée de tissu cérébral fœtal ainsi que de sérum non hémolysé de haute qualité à partir du même embryon de souris. Nous avons utilisé cette technique pour interroger comment l’exposition alimentaire maternelle affecte les profils de macronutriments et le développement neurologique fœtal chez des souris hétérozygotes pour Nf1 (neurofibromatose de type 1).
Il a été démontré que l’obésité induite par l’alimentation maternelle modifie le développement neurologique de la progéniture, ce qui peut entraîner une réduction des capacités cognitives, une hyperactivité et des altérations du comportement social. Les patients atteints de la maladie génétique cliniquement hétérogène Neurofibromatose de type 1 (NF1) peuvent présenter des déficits similaires, mais il n’est actuellement pas clair si des facteurs environnementaux tels que l’alimentation maternelle influencent le développement de ces phénotypes, et si oui, le mécanisme par lequel un tel effet se produirait. Pour permettre d’évaluer comment l’exposition maternelle au régime obésogène affecte les facteurs systémiques pertinents pour le développement neurologique dans la NF1, nous avons mis au point une méthode pour collecter simultanément du sérum non hémolysé et des cerveaux entiers ou micro-disséqués régionalement à partir de progénitures fœtales de mères murines nourries avec un régime témoin par rapport à un régime riche en graisses et en saccharose. Les cerveaux ont été traités pour la cryosection ou la congélation instantanée afin d’être utilisés pour l’isolement ultérieur de l’ARN ou des protéines ; La qualité du tissu collecté a été vérifiée par immunomarquage. La qualité du sérum a été vérifiée en analysant les profils de macronutriments. En utilisant cette technique, nous avons identifié que le régime obésogène maternel augmente le cholestérol sérique fœtal de la même manière entre les chiots WT et Nf1-hétérozygotes.
La neurofibromatose de type 1 (NF1) est considérée comme une RASopathie, un groupe de troubles caractérisés par des mutations génétiques germinales entraînant l’activation de la voie de signalisation RAS/MAPK (RAt Sarcoma virus/Mitogen-activated Protein Kinase). Les patients atteints de la RASopathie NF1 sont à risque de développer de nombreuses manifestations différentes, y compris des tumeurs bénignes et malignes du système nerveux central (gliome de la voie optique 1,2, gliome de haut grade 3,4) et périphérique (neurofibrome plexiforme 5,6, tumeur maligne de la gaine nerveuse périphérique 7,8) ainsi que des dysplasies osseuses9 et des anomalies pigmentaires cutanées10 (taches de rousseur axillaires, macles café-au-lait). L’effet de ce trouble sur la cognition et le développement neurologique est de plus en plus reconnu, les patients atteints de NF1 présentant une incidence accrue de déficits d’apprentissage, d’hyperactivité et de troubles du spectre autistique 11,12,13. Cependant, il existe une hétérogénéité significative dans le développement de ces phénotypes entre les patients 13,14,15,16,17, et il n’est pas clair pourquoi certains patients présentent des troubles cognitifs significatifs alors que d’autres ne sont pas affectés. Il a été démontré que l’obésité induite par l’alimentation maternelle affecte de la même manière l’apprentissage et le comportement dans la population générale 18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28, ce qui suggère que les expositions alimentaires maternelles différentielles à NF1 pourraient être l’une des sources de cette hétérogénéité clinique. En particulier, les enfants de mères obèses présentent un risque accru de développer une hyperactivité 18,19,20,23,25,26, un autisme 19,24,27, des déficits des fonctions exécutives 21,23 et des scores de QI à grande échelleplus faibles 22,28. Cependant, les patients atteints de NF1 ont des phénotypes métaboliques modifiés par rapport à la population générale, y compris une diminution de l’incidence de l’obésité et du diabète 29,30,31, ce qui fait qu’il n’est pas clair s’ils répondraient de la même manière aux stimuli diététiques.
Pour répondre à ces questions, nous avons souhaité déterminer si les changements induits par le régime obésogène du profil macronutritionnel chez la progéniture fœtale avec Nf1 contribuaient aux changements neurodéveloppementaux. Nous avons précédemment collecté des tissus entiers et micro-disséqués de haute qualité adaptés aux applications neurodéveloppementales dans le cerveau fœtal32. Cependant, la collecte de sang fœtal est difficile en raison de la petite taille du corps et du faible volume sanguin33. La collecte de sang par drainage assisté par gravité après la décapitation a conduit à de faibles volumes de collecte et à une hémolyse importante dans nos échantillons, ce qui peut affecter l’interprétation de l’application en aval. Le prélèvement par aspiration à partir du cœur fœtal ou des vaisseaux thoraciques, comme cela a été signalé précédemment33, était techniquement difficile et entraînait également une hémolyse fréquente. Nous avons donc développé une méthode de collecte de sérum fœtal, qui utilise des tubes capillaires spécialisés pour permettre une collecte de volume plus élevé sans stress de cisaillement important.
Ici, nous présentons cette méthode pour collecter simultanément des cerveaux embryonnaires et du sérum fœtal de petits hétérozygotes Nf1 exposés à un régime riche en graisses et en sucre par rapport à un régime témoin in utero (Figure 1 et tableau supplémentaire S1). Les cerveaux ont été cryo-intégrés pour une analyse ultérieure par immunofluorescence ou micro-disséqués régionalement et congelés pour une utilisation ultérieure dans des applications de biologie moléculaire. Un sérum de haute qualité a été obtenu, adapté aux applications en aval telles que le profilage des macronutriments. En utilisant cette méthode, nous avons identifié que l’exposition alimentaire maternelle à haute teneur en graisses et en saccharose entraîne une élévation des taux de cholestérol sérique chez les petits hétérozygotes WT et Nf1.
Les méthodes traditionnelles de prélèvement de sang chez la souris comprennent le rétrobulbaire, la veine caudale, la veine saphène, la veine faciale et le saignement de la veine jugulaire 40,41,42. Malheureusement, ces méthodes ne sont pas idéales pour la collecte de sang embryonnaire en raison de la taille de l’animal et de la petite et délicate vascularisation. La collecte de sang p…
The authors have nothing to disclose.
N Brossier est soutenu par le Francis S. Collins Scholars Program in Neurofibromatosis Clinical and Translational Research financé par le Neurofibromatosis Therapeutic Acceleration Program (NTAP, Grant # 210112). Cette publication a été financée en partie par le NTAP de la faculté de médecine de l’Université Johns Hopkins. Son contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles de la faculté de médecine de l’Université Johns Hopkins. Soutien supplémentaire de l’Hôpital pour enfants de Saint-Louis (FDN-2022-1082 au NMB) et du Centre de recherche sur le diabète de l’Université de Washington à Saint-Louis (NIH P30 DK020579). La microscopie a été réalisée à l’aide du Centre d’imagerie cellulaire de l’Université de Washington (WUCCI), soutenu par la faculté de médecine de l’Université de Washington, le Children’s Discovery Institute de l’Université de Washington et l’hôpital pour enfants de Saint-Louis (CDI-CORE-2015-505 et CDI-CORE-2019-813) et la Fondation de l’hôpital juif Barnes (3770 et 4642). Les souris Nestin-CFPnuc35 ont été généreusement fournies par Grigori Enikolopov (Renaissance School of Medicine, Stony Brook University, NY), et les souris Nf1 hétérozygotes pour une mutation germinale R681X ou C383X 32,38,39 ont été généreusement fournies par David Gutmann (Washington University School of Medicine, St. Louis, MO). La figure 1 a été créée avec BioRender.com.
#5/45 Forceps | Dumont | 11251-35 | tip shape: angled 45° |
4200 Tapestation | Agilent | G2991BA | Verify RNA integrity and quality, measurement of RIN values |
Benchtop Liquid Nitrogen Container | Thermo Fisher | 2122 | Or other cryo-safe container |
Control Chow | PicoLab | 5053 | Research diets D12328 (low-fat, low-sugar) may also be used. |
Curved Forceps | Cole Parmer | UX-10818-25 | Tip shape: curved 90° |
Dissecting blade handle | Cole-Parmer Essentials | 10822-20 | SS Siegel-Type, #10 to #15 blades |
EMS SuperCut Dissection Scissors | Electron microscope sciences | 72996-01 | 5½" (139.7 mm), Straight |
GFAP Antibody | Abcam | ab7260 | Dilute 1:350. Block with 10% serum containing 0.3 M Glycine. |
Glassvan Carbon Steel Surgical Blades, Size 11 | MYCO medical | 2001T-11 | #11 blades allow straight, flat cut |
Micro lab spoon | Az Scilab | A2Z-VL001 | stainless steel, autoclavable |
Micro scissors | Rubis | 78180-1C3 | model 1C300 |
Minivette POCT neutral | Sarstedt | 17.2111.050 | nominal volume: 50 µL, without preparation |
Nanorop | Thermo Fisher | 13-400-519 | Measure RNA concentration, 260/280 ratios |
Obesogenic diet | Researchdiets.com | D12331 | High-fat, high-sucrose |
Total Cholesterol Reagent | Thermo Fisher | TR13421 | Colorimetric detection |
β-actin antibody | Cell Signaling | 8457 | Dilute 1:1,000. |