概要

神経線維腫症1型における母親の食事療法が栄養と神経発達に及ぼす影響を評価するための胎児マウス脳と血清の同時収集

Published: May 17, 2024
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概要

このプロトコルでは、胎児の脳組織と、同じマウス胚からの高品質の非溶血血清を同時に収集する方法について説明します。この手法を利用して、母親の食事への曝露が 、Nf1 (神経線維腫症 1 型) のヘテロ接合型マウスの主要栄養素プロファイルと胎児の神経発達にどのように影響するかを調査しました。

Abstract

母親の食事誘発性肥満は、子孫の神経発達を変化させることが実証されており、認知能力の低下、多動性、および社会的行動の障害につながる可能性があります。臨床的に不均一な遺伝性疾患である神経線維腫症1型(NF1)の患者は、同様の欠損を呈する可能性がありますが、母親の食事などの環境要因がこれらの表現型の発達に影響を与えるかどうか、もしそうなら、そのような影響が発生するメカニズムは現在のところ不明です。母親の肥満食への曝露がNF1の神経発達に関連する全身因子にどのように影響するかを評価できるようにするために、対照食と高脂肪、高ショ糖食を与えられたマウスダムの胎児の子孫から、非溶血血清と全体または局所的に微視された脳を同時に収集する方法を開発しました。脳は凍結切片処理のために処理されたか、またはその後のRNAまたはタンパク質の単離に使用するために瞬間凍結されました。採取した組織の品質を免疫染色により確認しました。血清の品質は、主要栄養素プロファイルを分析することにより確認しました。この手法を用いて、母体の肥満食は、WTと Nf1-ヘテロ接合性の子犬の間で胎児の血清コレステロールを同様に増加させることを同定した。

Introduction

神経線維腫症 1 型 (NF1) は、RAS/MAPK (RAt 肉腫ウイルス/マイトジェン活性化プロテイン キナーゼ) シグナル伝達経路の活性化をもたらす生殖細胞系遺伝子変異を特徴とする障害群である RASopathy と考えられています。NF1 RASopathyの患者は、中枢性腫瘍(視神経膠腫1,2、高悪性度神経膠腫3,4)および末梢性腫瘍(フジツボ神経線維腫5,6、悪性度末梢神経鞘腫瘍7,8)の良性腫瘍と悪性腫瘍の両方、ならびに骨異形成9および皮膚色素異常10を含む、多くの異なる症状を発症するリスクがあります(腋窩そばかす、カフェオレ斑)。この障害が認知と神経発達に及ぼす影響はますます認識されており、NF1患者は学習障害、多動性、および自閉症スペクトラム障害の発生率の増加を示しています11,12,13。しかし、患者1314151617の間でこれらの表現型の発達には有意な不均一性があり、一部の患者が重大な認知障害を示し、他の患者が影響を受けない理由は不明です。母親の食事誘発性肥満は、一般集団18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28の学習と行動に同様に影響を与えることが示されていますから、NF1における母親の食事曝露の違いが、この臨床的不均一性の1つの原因である可能性があることを示唆しています。特に、肥満の母親の子供は、多動18,19,20,23,25,26、自閉症19,24,27、実行機能障害21,23を発症するリスクが高く、フルスケールIQスコア22,28が低くなります.しかし、NF1の患者は、肥満や糖尿病の発生率の低下など、一般集団と比較して代謝表現型が変化しており29,30,31、食事刺激と同様に反応するかどうかは不明です。

これらの疑問に答えるために、 Nf1 の胎児の仔における肥満食療法による主要栄養素プロファイルの変化が神経発達の変化に寄与しているかどうかを検討したいと考えました。我々は以前に、胎児の脳32から神経発達への応用に適した高品質の全体および領域的に微小解剖された組織を収集してきた。しかし、胎児の採血は、体が小さく、血液量が少ないため困難です33。斬首後の重力を利用したドレナージによる採血は、サンプル中の採血量が少なく、溶血が著しいことにつながり、下流のアプリケーションの解釈に影響を与える可能性があります。胎児の心臓または胸部血管からの吸引による採取は、以前に報告されているように33、技術的に困難であり、頻繁な溶血ももたらした。そこで、特殊な毛細血管チューブを利用して、大きなせん断応力なしに大量の採取を可能にする胎児血清採取法を開発しました。

ここでは、子宮内で高脂肪、高糖の食事と対照の食事に曝露されたNf1ヘテロ接合体の子犬から胚の脳と胎児の血清を同時に収集するこの方法を紹介します(1および補足表S1)。脳は、免疫蛍光法によるその後の分析のためにクライオ包埋されたか、または分子生物学アプリケーションでのその後の使用のために領域的にマイクロ解剖され、瞬間凍結されました。高品位な血清が得られ、主要栄養素プロファイリングなどのダウンストリームアプリケーションに適しています。この方法を利用して、母親の高脂肪、高ショ糖の食事への曝露が、WTおよびNf1-ヘテロ接合性の子犬の両方で血清コレステロール値の上昇につながることを突き止めました。

Protocol

この研究のすべての動物手順はNIHのガイドラインに従い、セントルイスのワシントン大学の施設動物管理および使用委員会によって承認されました。動物は、標準的な12時間のライト:ダークサイクリングと、食べ物と水への無料アクセスで収容されました。 1.母性ダイエット 雌マウスを4週齢でコントロールチャウ(CD)または?…

Representative Results

この技術によって得られた脳組織の質を説明するために、我々は、以前に報告された技術32に従ってGFAPについて免疫染色されたNestin−CFPnucマウス35からのサンプル胎児脳を示す。Nestin+細胞が側脳室の内側を覆っているのが見られ(図2A)、表面からGFAP+フィラメントが伸びています。CDの側脳室に…

Discussion

マウスから血液を採取する従来の方法には、球後静脈、尾静脈、伏在静脈、顔面静脈、および頸静脈出血40,41,42が含まれる。残念ながら、これらの方法は、動物のサイズと小さくて繊細な血管系のために、胚の採血には理想的ではありません。斬首後の重力を利用したドレナージによる採血は、サ…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

N Brossierは、神経線維腫症治療加速プログラム(NTAP、助成金#210112)によって資金提供された神経線維腫症臨床およびトランスレーショナル研究のフランシスS.コリンズ奨学生プログラムによってサポートされています。この出版物は、ジョンズ・ホプキンス大学医学部のNTAPからの資金提供によって部分的に支援されました。その内容は著者の責任であり、必ずしもジョンズ・ホプキンス大学医学部の公式見解を表すものではありません。St. Louis Children’s Hospital(FDN-2022-1082からNMB)およびWashington University in St. Louis Diabetes Research Core(NIH P30 DK020579)による追加支援。顕微鏡検査は、ワシントン大学医学部、ワシントン大学小児発見研究所、セントルイス小児病院(CDI-CORE-2015-505およびCDI-CORE-2019-813)およびバーンズ・ユダヤ病院財団(3770および4642)の支援を受けて、ワシントン大学細胞イメージングセンター(WUCCI)を使用して実施しました。Nestin-CFPnuc35マウスは、Grigori Enikolopov氏(ルネッサンス医学部、ストーニーブルック大学、ニューヨーク州)から提供され、R681XまたはC383X生殖細胞変異32,38,39のいずれかに対してヘテロ接合性のNf1マウスは、David Gutmann氏(ワシントン大学医学部、ミズーリ州セントルイス)から寛大に提供されました。図 1 は BioRender.com を使用して作成されました。

Materials

#5/45 Forceps Dumont  11251-35 tip shape: angled 45°
4200 Tapestation Agilent G2991BA Verify RNA integrity and quality, measurement of RIN values
Benchtop Liquid Nitrogen Container Thermo Fisher 2122 Or other cryo-safe container
Control Chow PicoLab 5053 Research diets D12328 (low-fat, low-sugar) may also be used.
Curved Forceps Cole Parmer UX-10818-25 Tip shape: curved 90°
Dissecting blade handle Cole-Parmer Essentials 10822-20 SS Siegel-Type, #10 to #15 blades
EMS SuperCut Dissection Scissors Electron microscope sciences 72996-01 5½" (139.7 mm), Straight
GFAP Antibody Abcam ab7260 Dilute 1:350. Block with 10% serum containing 0.3 M Glycine.
Glassvan Carbon Steel Surgical Blades, Size 11 MYCO medical 2001T-11 #11 blades allow straight, flat cut
Micro lab spoon Az Scilab A2Z-VL001 stainless steel, autoclavable
Micro scissors Rubis 78180-1C3 model 1C300
Minivette POCT neutral Sarstedt 17.2111.050 nominal volume: 50 µL, without preparation
Nanorop Thermo Fisher 13-400-519 Measure RNA concentration, 260/280 ratios
Obesogenic diet Researchdiets.com D12331 High-fat, high-sucrose
Total Cholesterol Reagent Thermo Fisher TR13421 Colorimetric detection
β-actin antibody Cell Signaling 8457 Dilute 1:1,000.

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記事を引用
Martin, G. E., Chan, A., Brossier, N. M. Concurrent Collection of Fetal Murine Brain and Serum to Assess Effects of Maternal Diet on Nutrition and Neurodevelopment in Neurofibromatosis Type 1. J. Vis. Exp. (207), e66226, doi:10.3791/66226 (2024).

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