Un test chimico acetil-click per misurare l'acetiltransferasi istonica 1

Tra le numerose acetiltransferasi eucariotiche, HAT1 è stata la prima istone acetiltransferasi ad essere isolata ^1,2,3. Indagini successive hanno stabilito il suo ruolo fondamentale nella replicazione della cromatina, in particolare nella sintesi di nuovi nucleosomi durante la fase^{S 4}. I nostri sforzi di ricerca hanno portato al riconoscimento che HAT1 è altamente stimolato dal trattamento con fattore di crescita epidermico (EGF) nelle cellule mammarie⁵. Inoltre, è venuto alla luce che HAT1 è necessario per una rapida proliferazione cellulare e formazione tumorale in vivo 6,7,8,9. I dati indicano che HAT1 è fondamentale nel coordinare i processi anabolici ed epigenetici per la divisione cellulare, guidando la crescita del tumore.

HAT1 di-acetila la coda amino-terminale dell’istone H4 sulle lisine 5 e 12 in complesso con la proteina chaperone Rbap46, che lega l’istone e presenta l’amino-terminale a HAT1. I tetrameri istonici o disomi¹⁰, insieme a HAT1/Rbap46 e altri chaperoni istonici¹¹, vengono quindi importati nel nucleo. Gli istoni vengono quindi rilasciati per essere depositati sulla forcella di replicazione o in altri siti per supportare l’attivazione o la repressione genica. La funzione del segno di diacetilazione HAT1 sull’istone H4 non è completamente compresa. È probabile che venga rapidamente rimosso entro un intervallo di 15-30 minuti dall’azione delle deacetilasi istoniche 12,13,14,15 dopo che H4 è stato inserito nella cromatina. Pertanto, il marchio di diacetilazione HAT1 non si propaga nella cromatina e potrebbe non svolgere un vero ruolo epigenetico, sebbene sia stato ipotizzato un ruolo nel reclutamento di enzimi modificanti la cromatina nella cromatina nascente¹². Inoltre, HAT1 non acetila direttamente la cromatina; La sua attività è limitata agli istoni solubili.

Lo sviluppo di inibitori dell’acetiltransferasi istonica a piccole molecole è stato ostacolato da saggi aspecifici e a basso rendimento, che spesso hanno portato alla generazione di composti biologicamente reattivi ^16,17. Il test gold standard per misurare le attività dell’acetiltransferasi richiede l’uso di ³H-acetil-coA, che limita la produttività e richiede radiazioni. Ciononostante, recentemente sono stati descritti e confermati inibitori specifici e altamente potenti dell’acetiltransferasi a piccole molecole che hanno come bersaglio CBP/p300¹⁸ e KAT6A/B^19,20 attraverso l’uso di ³H-acetil-CoA. In futuro, si stanno studiando saggi migliorati per ottenere una migliore produttività ed evitare i rischi di laboratorio.

I recenti progressi nel monitoraggio dell’acetilazione²¹ hanno utilizzato la click chemistry per consentire il monitoraggio delle reazioni enzimatiche. Esiste una varietà di precursori click-enabled che sono accessibili tramite semplici vie sintetiche o disponibili per l’acquisto che possono essere incorporati nelle reazioni enzimatiche. Queste reazioni sono tipicamente condotte in sistemi ricombinanti, sebbene siano possibili anche saggi basati su cellule²². Il vantaggio dei cofattori e dei substrati abilitati al clic è che lo screening può misurare direttamente l’attività enzimatica senza la necessità di sistemi di lettura accoppiati che sono spesso perturbati dai composti di screening e richiedono ulteriori passaggi di manipolazione. Ciò consente trattamenti con inibitori solo durante la fase enzimatica, mentre tutte le fasi di funzionalizzazione e rilevamento a valle vengono eseguite dopo un lavaggio approfondito per rimuovere i composti, limitando così il potenziale di interferenza del saggio. Questi vantaggi rendono la progettazione di saggi click-enabled preferibile ai saggi accoppiati che comunemente si basano sulla rilevazione del coenzima A libero.

Una considerazione importante è l’accettazione di cofattori abilitati al clic nel sito attivo dell’enzima. I cofattori abilitati per i clic esistenti potrebbero non essere completamente compatibili con il sito attivo ottimizzato per il cofattore nativo. Le informazioni strutturali e la modellazione possono essere utilizzate per progettare sostituzioni di amminoacidi per allargare il sito attivo per incorporare substrati alterati²³. Ciò può consentire lo screening con una migliore cinetica enzimatica e livelli più bassi di substrato ed enzimi. Lo svantaggio di questo approccio è che le tasche catalitiche alterate potrebbero non identificare gli inibitori che interagiscono fortemente con l’enzima nativo. In definitiva, è necessaria una combinazione di approcci per identificare e convalidare potenziali inibitori enzimatici.

Qui, descriviamo un metodo sviluppato per purificare e saggiare l’attività dell’enzima HAT1 utilizzando il cofattore click 4-penninoil-CoA²⁴. Questo test (Figura 1) utilizza la sequenza enzimatica nativa in complesso con la sua proteina partner richiesta Rbap46, che ha dimostrato di aumentare l’attività enzimatica. La purificazione dell’enzima dalle cellule umane consente l’attivazione enzimatica nella cellulo, che può preservare le stimolanti modificazioni post-traduzionali importanti per la piena attività enzimatica. La progettazione e l’ottimizzazione di saggi enzimatici ricombinanti per schermi chimici ad alto rendimento sono state utilizzate con successo per identificare e caratterizzare gli inibitori delle piccole molecole HAT1.