Summary

Un test chimico acetil-click per misurare l'acetiltransferasi istonica 1

Published: January 26, 2024
doi:

Summary

Saggi chimici rapidi e accurati per lo screening di inibitori specifici sono uno strumento importante nell’arsenale di sviluppo dei farmaci. Qui, presentiamo un saggio chimico scalabile acetil-click per misurare l’inibizione dell’attività di acetilazione di HAT1.

Abstract

HAT1, noto anche come istone acetiltransferasi 1, svolge un ruolo cruciale nella sintesi della cromatina stabilizzando e acetilando l’H4 nascente prima dell’assemblaggio del nucleosoma. È necessario per la crescita del tumore in vari sistemi, il che lo rende un potenziale bersaglio per il trattamento del cancro. Per facilitare l’identificazione di composti in grado di inibire l’attività enzimatica di HAT1, abbiamo ideato un saggio acetil-click per uno screening rapido. In questo semplice saggio, impieghiamo HAT1/Rbap46 ricombinante, che viene purificato da cellule umane attivate. Il metodo utilizza l’analogo dell’acetil-CoA 4-pentinoil-CoA (4P) in un approccio click-chemistry. Ciò comporta il trasferimento enzimatico di un manico alchino attraverso una reazione di acilazione HAT1-dipendente a un peptide N-terminale H4 biotinilato. Il peptide catturato viene quindi immobilizzato su piastre di neutravidina, seguita da una funzionalizzazione click-chemistry con biotina-azide. Successivamente, il reclutamento della streptavidina-perossidasi viene impiegato per ossidare il rosso amplex, con conseguente emissione fluorescente quantitativa. Introducendo inibitori chimici durante la reazione di acilazione, possiamo quantificare l’inibizione enzimatica in base ad una riduzione del segnale di fluorescenza. È importante sottolineare che questa reazione è scalabile, consentendo lo screening ad alto rendimento di potenziali inibitori per l’attività enzimatica di HAT1.

Introduction

Tra le numerose acetiltransferasi eucariotiche, HAT1 è stata la prima istone acetiltransferasi ad essere isolata 1,2,3. Indagini successive hanno stabilito il suo ruolo fondamentale nella replicazione della cromatina, in particolare nella sintesi di nuovi nucleosomi durante la faseS 4. I nostri sforzi di ricerca hanno portato al riconoscimento che HAT1 è altamente stimolato dal trattamento con fattore di crescita epidermico (EGF) nelle cellule mammarie5. Inoltre, è venuto alla luce che HAT1 è necessario per una rapida proliferazione cellulare e formazione tumorale in vivo 6,7,8,9. I dati indicano che HAT1 è fondamentale nel coordinare i processi anabolici ed epigenetici per la divisione cellulare, guidando la crescita del tumore.

HAT1 di-acetila la coda amino-terminale dell’istone H4 sulle lisine 5 e 12 in complesso con la proteina chaperone Rbap46, che lega l’istone e presenta l’amino-terminale a HAT1. I tetrameri istonici o disomi10, insieme a HAT1/Rbap46 e altri chaperoni istonici11, vengono quindi importati nel nucleo. Gli istoni vengono quindi rilasciati per essere depositati sulla forcella di replicazione o in altri siti per supportare l’attivazione o la repressione genica. La funzione del segno di diacetilazione HAT1 sull’istone H4 non è completamente compresa. È probabile che venga rapidamente rimosso entro un intervallo di 15-30 minuti dall’azione delle deacetilasi istoniche 12,13,14,15 dopo che H4 è stato inserito nella cromatina. Pertanto, il marchio di diacetilazione HAT1 non si propaga nella cromatina e potrebbe non svolgere un vero ruolo epigenetico, sebbene sia stato ipotizzato un ruolo nel reclutamento di enzimi modificanti la cromatina nella cromatina nascente12. Inoltre, HAT1 non acetila direttamente la cromatina; La sua attività è limitata agli istoni solubili.

Lo sviluppo di inibitori dell’acetiltransferasi istonica a piccole molecole è stato ostacolato da saggi aspecifici e a basso rendimento, che spesso hanno portato alla generazione di composti biologicamente reattivi 16,17. Il test gold standard per misurare le attività dell’acetiltransferasi richiede l’uso di 3H-acetil-coA, che limita la produttività e richiede radiazioni. Ciononostante, recentemente sono stati descritti e confermati inibitori specifici e altamente potenti dell’acetiltransferasi a piccole molecole che hanno come bersaglio CBP/p30018 e KAT6A/B19,20 attraverso l’uso di 3H-acetil-CoA. In futuro, si stanno studiando saggi migliorati per ottenere una migliore produttività ed evitare i rischi di laboratorio.

I recenti progressi nel monitoraggio dell’acetilazione21 hanno utilizzato la click chemistry per consentire il monitoraggio delle reazioni enzimatiche. Esiste una varietà di precursori click-enabled che sono accessibili tramite semplici vie sintetiche o disponibili per l’acquisto che possono essere incorporati nelle reazioni enzimatiche. Queste reazioni sono tipicamente condotte in sistemi ricombinanti, sebbene siano possibili anche saggi basati su cellule22. Il vantaggio dei cofattori e dei substrati abilitati al clic è che lo screening può misurare direttamente l’attività enzimatica senza la necessità di sistemi di lettura accoppiati che sono spesso perturbati dai composti di screening e richiedono ulteriori passaggi di manipolazione. Ciò consente trattamenti con inibitori solo durante la fase enzimatica, mentre tutte le fasi di funzionalizzazione e rilevamento a valle vengono eseguite dopo un lavaggio approfondito per rimuovere i composti, limitando così il potenziale di interferenza del saggio. Questi vantaggi rendono la progettazione di saggi click-enabled preferibile ai saggi accoppiati che comunemente si basano sulla rilevazione del coenzima A libero.

Una considerazione importante è l’accettazione di cofattori abilitati al clic nel sito attivo dell’enzima. I cofattori abilitati per i clic esistenti potrebbero non essere completamente compatibili con il sito attivo ottimizzato per il cofattore nativo. Le informazioni strutturali e la modellazione possono essere utilizzate per progettare sostituzioni di amminoacidi per allargare il sito attivo per incorporare substrati alterati23. Ciò può consentire lo screening con una migliore cinetica enzimatica e livelli più bassi di substrato ed enzimi. Lo svantaggio di questo approccio è che le tasche catalitiche alterate potrebbero non identificare gli inibitori che interagiscono fortemente con l’enzima nativo. In definitiva, è necessaria una combinazione di approcci per identificare e convalidare potenziali inibitori enzimatici.

Qui, descriviamo un metodo sviluppato per purificare e saggiare l’attività dell’enzima HAT1 utilizzando il cofattore click 4-penninoil-CoA24. Questo test (Figura 1) utilizza la sequenza enzimatica nativa in complesso con la sua proteina partner richiesta Rbap46, che ha dimostrato di aumentare l’attività enzimatica. La purificazione dell’enzima dalle cellule umane consente l’attivazione enzimatica nella cellulo, che può preservare le stimolanti modificazioni post-traduzionali importanti per la piena attività enzimatica. La progettazione e l’ottimizzazione di saggi enzimatici ricombinanti per schermi chimici ad alto rendimento sono state utilizzate con successo per identificare e caratterizzare gli inibitori delle piccole molecole HAT1.

Protocol

1. Metodo 1: produzione e purificazione del complesso ricombinante HAT1/Rbap46 Scongelamento, recupero ed espansione delle cellule HEK293fScongelare 1-10 milioni di cellule di mammifero HEK293f26 in terreni di espressione freestyle 293 da 30 mL in un pallone da 100 mL. Incubare in CO2 all’8% a 37 °C ruotando a 60 giri/min. Il giorno successivo, contare e controllare la vitalità delle celle, quindi regolare la velocità di rotazione a 120 g…

Representative Results

Le curve standard in duplicato (16 pozzetti) devono essere incluse su ogni piastra per garantire una corretta esecuzione del saggio. I dati della curva standard devono essere impostati sotto forma di tabella, con un intervallo compreso tra il 100% e lo 0% in base al rapporto tra il peptide contenente Pra e il peptide H4 nativo in soluzione (Tabella 1). Il segnale rosso di Amplex sarà il più alto nei pozzetti peptidici H4 nativi al 100% pra/0% e il più basso nei pozzetti peptidici H4 nativi allo 0% pra…

Discussion

Nell’ultimo decennio, la click chemistry è diventata importante20, consentendo la progettazione precisa di strutture chimiche interagenti. In questo contesto, varie connessioni covalenti bioortogonali21 sono emerse come opzioni promettenti per la formazione di complessi nel loro ambiente naturale. La chimica dei clic impiega coppie di gruppi funzionali che mostrano reazioni rapide e selettive, comunemente note come “reazioni di clic”. Queste reazioni si verificano in modo …

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo George Zheng per aver fornito H4K12CoA. Ringraziamo i membri del Gruber Lab per le utili discussioni e feedback. Ringraziamo il supporto di NIH/NCI (1K08CA245024), CPRIT (RR200090) e V Foundation (V2022-022).

Materials

4P CoA Cayman Chemical 10547 Click chemistry co-factor
Amplex Red Fisher Sci A12222 Fluorescence substrate
Biotin-PEG-Azide Alfa Aesar J64996MC Click chemistry
Copper Sulfate Sigma-aldrich  7758-98-7 Click chemistry
DMSO Fisher Scientific  67-68-5 diluent
DTT Acros Organics 03-12-3483 reducting agent
Forskolin VWR 102987-310 Protein expression
Freestyle 293 Expression Medium Thermo Fisher 12338018 Media
Freestyle 293-F cells Thermo Fisher R790-07 Protein expression
H4-peptide/1-23-GGK-biotin Anaspec AS65097 peptide substrate
HEPES Sigma-aldrich  7365-45-9 EB buffer
Hydrogen peroxide 30% solution Sigma-aldrich  Z00183-99-0 initiator
M2 FLAG antibody slurry Millipore-Sigma A2220 Protein purification
Macrosep 10K Filter (Pall Lab) VWR 89131-980 Protein purification
Neutravidin Plate Thermo Sci 15127 BSA-pre-blocked
NP40 (IGEPAL) MP Biomedical 198596 20x buffer
pHEK-293 plasmid Takara Bio 3390 Protein expression
Phosphate Buffered Saline 10x Alfa Aesar  Z00082-33-6 wash buffer
Pra peptide Genscript Custom synthesis biotinylated
Sodium Ascorbate Sigma-aldrich  134-03-2 Click chemistry
Sodium chloride Sigma-aldrich  7647-14-5 EB buffer
Sodium phosphate VWR International 7558-80-7 buffer
Streptavidin EMD Millipore 189730 competitor
Streptavidin-HRP Cell Signaling 3999S enzyme
THPTA ligand Fisher Sci 1010-500 Click chemistry
Tris base Sigma-aldrich  77-86-1 20x buffer
Triton-X 100 VWR International  9002-93-1 EB buffer
Tween-20 Sigma-aldrich  9005-64-5 Wash buffer
Urea Sigma-Aldrich 57-13-6 quencher

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Citer Cet Article
Rajkumar, S., Dixon, D., Lipchik, A. M., Gruber, J. J. An Acetyl-Click Chemistry Assay to Measure Histone Acetyltransferase 1 Acetylation. J. Vis. Exp. (203), e66054, doi:10.3791/66054 (2024).

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