Preparazione e colorazione in immunofluorescenza di fasci e cellule a fibra singola dalla corteccia e dal nucleo del cristallino dell'occhio

Il cristallino è un tessuto trasparente e ovoidale nella camera anteriore dell’occhio costituito da due tipi di cellule, cellule epiteliali e fibre 1 (Figura 1). C’è un monostrato di cellule epiteliali che copre l’emisfero anteriore del cristallino. Le cellule fibrose sono differenziate dalle cellule epiteliali e costituiscono la maggior parte del cristallino. Le cellule fibrose altamente specializzate subiscono una programmazione di allungamento, differenziazione e maturazione, caratterizzata da cambiamenti distinti nella morfologia della membrana cellulare dalla periferia del cristallino al centro del cristallino 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 , noto anche come nucleo del cristallino. La funzione del cristallino di mettere a fuoco con precisione la luce proveniente da varie distanze sulla retina dipende dalle sue proprietà biomeccaniche, tra cui rigidità ed elasticità 13,14,15,16,17,18,19. Le complesse interdigitazioni delle fibre del cristallino sono state ipotizzate^20,21 e recentemente hanno dimostrato di essere importanti per la rigidità del cristallino^22,23.

Figura 1: Diagrammi anatomici della lente e immagini rappresentative di microscopia elettronica a scansione (SEM) dalle fibre della lente. La vignetta mostra una vista longitudinale (da anteriore a posteriore dall’alto verso il basso) del monostrato anteriore di cellule epiteliali (ombreggiato in azzurro) e una massa di cellule in fibra del cristallino (bianco). Il centro della lente (sfumato in rosa) è noto come nucleo e comprende cellule di fibre altamente compattate. A destra, una vignetta in sezione trasversale rivela la forma allungata delle celle esagonali delle fibre delle lenti che sono impacchettate in un motivo a nido d’ape. Le celle in fibra hanno due lati larghi e quattro lati corti. Immagini SEM rappresentative lungo il fondo mostrano le complesse interdigitazioni della membrana tra le cellule delle fibre della lente a diverse profondità della lente. Da destra, le fibre della lente appena formate alla periferia della lente hanno piccole sporgenze lungo i lati corti e sfere e prese lungo il lato largo (caselle rosse). Durante la maturazione, le fibre del cristallino sviluppano ampi domini a paletta che sono decorati da piccole sporgenze lungo i lati corti (scatole blu). Le cellule fibrose mature possiedono ampi domini a paletta illustrati da piccole sporgenze. Questi domini ad incastro sono importanti per le proprietà biomeccaniche delle lenti. Le cellule fibrose nel nucleo del cristallino hanno meno piccole sporgenze lungo i loro lati corti e hanno complesse interdigitazioni maschio-femmina (scatole viola). I lati larghi della cellula mostrano una morfologia di membrana globulare. Il cartone animato è stato modificato da^22,32 e non disegnato in scala. Barra della scala = 3 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

La lente cresce aggiungendo gusci di nuove celle di fibre sovrapposte alle precedenti generazioni di fibre^24,25. Le celle in fibra hanno una forma a sezione trasversale allungata ed esagonale con due lati larghi e quattro lati corti. Queste cellule si estendono dal polo anteriore a quello posteriore del cristallino e, a seconda della specie, le fibre del cristallino possono essere lunghe diversi millimetri. Per sostenere la struttura di queste cellule allungate e sottili, interdigitazioni specializzate lungo i lati larghi e corti creano strutture ad incastro per mantenere la forma della lente e le proprietà biomeccaniche. I cambiamenti nella forma della membrana cellulare durante la differenziazione e la maturazione delle cellule delle fibre sono stati ampiamente documentati dagli studi di microscopia elettronica (EM) 2,3,4,5,6,7,8,9,10,20,26,27,28,29 . Le cellule fibrose di nuova formazione hanno sfere e prese lungo i loro lati larghi con sporgenze molto piccole lungo i loro lati corti, mentre le fibre mature hanno sporgenze e pale ad incastro lungo i loro lati corti. Le fibre nucleari mostrano interdigitazioni maschio-femmina e morfologia della membrana globulare. Poco si sa sulle proteine necessarie per queste complesse membrane ad incastro. Precedenti studi sulla localizzazione delle proteine nelle cellule fibrose si sono basati su sezioni di tessuto del cristallino, che non consentono una chiara visualizzazione della complessa architettura cellulare.

Questo lavoro ha creato e perfezionato un nuovo metodo per fissare singole cellule e fasci di cellule a fibra del cristallino per preservare la complessa morfologia e per consentire l’immunocolorazione delle proteine alla membrana cellulare e all’interno del citoplasma. Questo metodo preserva fedelmente l’architettura della membrana cellulare, paragonabile ai dati degli studi EM, e consente la colorazione con anticorpi primari per proteine specifiche. In precedenza abbiamo immunocolorato le fibre del cristallino corticale in fase di differenziazione e maturazione^22,23. In questo protocollo, c’è anche un nuovo metodo per colorare le cellule delle fibre dal nucleo del cristallino. Questo protocollo apre le porte alla comprensione dei meccanismi di formazione e dei cambiamenti nelle interdigitazioni di membrana durante la maturazione delle cellule fibrose e la compattazione del nucleo del cristallino.