Подготовка и иммунофлуоресцентное окрашивание пучков и клеток отдельных волокон коры и ядра хрусталика глаза

Хрусталик представляет собой прозрачную яйцевидную ткань в передней камере глаза, состоящую из двух типов клеток: эпителиальных и волоконных^{клеток1} (рис. 1). Существует монослой эпителиальных клеток, который покрывает переднее полушарие хрусталика. Волоконные клетки дифференцируются от эпителиальных клеток и составляют основную часть хрусталика. Высокоспециализированные волоконные клетки подвергаются программированию удлинения, дифференцировки и созревания, отмеченному отчетливыми изменениями морфологии клеточной мембраны от периферии хрусталика к центру хрусталика 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 , также известный как ядро хрусталика. Функция хрусталика точно фокусировать свет, поступающий с различных расстояний на сетчатку, зависит от его биомеханических свойств, включая жесткость и эластичность 13,14,15,16,17,18,19. Были выдвинуты гипотезы о сложных взаимосвязях волокон хрусталика 20,21 и недавно показано, что они важны для жесткости хрусталика ^22,23.

Рисунок 1: Диаграммы анатомии хрусталика и репрезентативные изображения волокон хрусталика методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ). На рисунке показан продольный (от переднего к заднему сверху вниз) вид переднего монослоя эпителиальных клеток (заштрихован светло-голубым цветом) и объемной массы клеток хрусталика (белый). Центр хрусталика (заштрихован розовым цветом) известен как ядро и состоит из сильно уплотненных волоконных клеток. Справа на поперечном срезе изображена вытянутая шестиугольная форма ячеек волокон хрусталика, упакованных в сотовый рисунок. Ячейки волокна имеют две широкие стороны и четыре короткие. Репрезентативные СЭМ-изображения вдоль дна показывают сложные мембранные взаимосвязи между клетками волокон хрусталика на разной глубине хрусталика. Справа новообразованные волокна хрусталика на периферии хрусталика имеют небольшие выступы по коротким сторонам и шарико-гнездовые гнезда по широкой стороне (красные прямоугольники). Во время созревания волокна хрусталика развивают крупные лопастные домены, которые украшены небольшими выступами по коротким сторонам (синими прямоугольниками). Зрелые волокнистые клетки обладают большими лопастичными доменами, проиллюстрированными небольшими выступами. Эти взаимосвязанные домены важны для биомеханических свойств линз. Волокнистые клетки в ядре хрусталика имеют меньше мелких выступов вдоль своих коротких сторон и имеют сложные шпунтовые интердигитации (фиолетовые коробочки). На широких сторонах клетки наблюдается морфология шаровой мембраны. Мультфильм был изменен с^22,32 и не нарисован в масштабе. Масштабная линейка = 3 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Хрусталик растет за счет добавления оболочек из новых волоконных ячеек, наложенных поверх волокон предыдущих поколений^24,25. Ячейки волокна имеют вытянутую, шестиугольную форму поперечного сечения с двумя широкими сторонами и четырьмя короткими сторонами. Эти клетки простираются от переднего до заднего полюса хрусталика, и в зависимости от вида, волокна хрусталика могут быть несколько миллиметров в длину. Чтобы поддерживать структуру этих удлиненных и тонких клеток, специализированные взаимосвязи вдоль широкой и короткой сторон создают взаимосвязанные структуры для поддержания формы хрусталика и биомеханических свойств. Изменения формы клеточной мембраны во время дифференцировки и созревания волоконных клеток были подробно задокументированы исследованиями электронной микроскопии (ЭМ) 2,3,4,5,6,7,8,9,10,20,26,27,28,29 . Новообразованные волокнистые клетки имеют шарики и гнезда вдоль своих широких сторон с очень маленькими выступами вдоль коротких сторон, в то время как зрелые волокна имеют взаимосвязанные выступы и лопасти вдоль коротких сторон. Ядерные волокна демонстрируют шпунтовые интердигитации и морфологию глобулярной мембраны. Мало что известно о белках, которые необходимы для этих сложных взаимосвязанных мембран. Предыдущие исследования локализации белков в волоконных клетках основывались на срезах ткани хрусталика, которые не позволяют четко визуализировать сложную клеточную архитектуру.

Эта работа создала и усовершенствовала новый метод фиксации отдельных и пучков клеток волокон хрусталика для сохранения сложной морфологии и обеспечения иммуноокрашивания белков на клеточной мембране и в цитоплазме. Этот метод достоверно сохраняет архитектуру клеточной мембраны, сопоставимую с данными ЭМ-исследований, и позволяет окрашивать первичными антителами к конкретным белкам. Ранее у нас были иммуноокрашенные кортикальные волокна хрусталика, подвергающиеся дифференцировке и созреванию^22,23. В этом протоколе также есть новый метод окрашивания клеток волокна из ядра хрусталика. Этот протокол открывает дверь к пониманию механизмов формирования и изменений мембранных интердигитов во время созревания клеток волокна и уплотнения ядра хрусталика.