Preparo e Coloração por Imunofluorescência de Feixes e Células Monofibrais do Córtex e Núcleo do Cristalino Ocular

O cristalino é um tecido límpido e ovoide, na câmara anterior do olho, composto por dois tipos celulares, células epiteliais e^fibras1 (Figura 1). Existe uma monocamada de células epiteliais que recobre o hemisfério anterior do cristalino. As células fibrosas são diferenciadas das células epiteliais e compõem a maior parte do cristalino. As células fibrosas altamente especializadas sofrem uma programação de alongamento, diferenciação e maturação, marcada por distintas mudanças na morfologia da membrana celular da periferia do cristalino para o centro do cristalino2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 , também conhecido como núcleo do cristalino. A função do cristalino de focalizar a luz vinda de várias distâncias para a retina depende de suas propriedades biomecânicas, incluindo rigidez e elasticidade 13,14,15,16,17,18,19. As complexas interdigitações das fibras do cristalino foram hipotetizadas 20,21 e recentemente mostraram-se importantes para a rigidez do cristalino ^22,23.

Figura 1: Diagramas de anatomia do cristalino e imagens representativas de microscopia eletrônica de varredura (MEV) das fibras do cristalino. O desenho mostra uma visão longitudinal (anterior a posterior de cima para baixo) da monocamada anterior de células epiteliais (sombreada em azul claro) e uma massa volumosa de células de fibra do cristalino (branco). O centro da lente (sombreado em rosa) é conhecido como núcleo e compreende células de fibra altamente compactadas. À direita, um desenho animado de seção transversal revela a forma de célula hexagonal alongada das fibras da lente que são embaladas em um padrão de favo de mel. As células de fibra têm dois lados largos e quatro lados curtos. Imagens SEM representativas ao longo da parte inferior mostram as interdigitações complexas da membrana entre as células de fibra da lente em diferentes profundidades da lente. A partir da direita, as fibras de lente recém-formadas na periferia da lente têm pequenas saliências ao longo dos lados curtos e bolas e soquetes ao longo do lado largo (caixas vermelhas). Durante a maturação, as fibras do cristalino desenvolvem grandes domínios de remo que são decorados por pequenas saliências ao longo dos lados curtos (caixas azuis). As células de fibras maduras possuem grandes domínios de pás ilustrados por pequenas saliências. Esses domínios de intertravamento são importantes para as propriedades biomecânicas das lentes. As células de fibra no núcleo do cristalino têm menos pequenas saliências ao longo de seus lados curtos e têm interdigitações complexas de língua e sulco (caixas roxas). Os lados largos da célula exibem uma morfologia de membrana globular. O desenho foi modificado de^22,32 e não desenhado em escala. Barra de escala = 3 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A lente cresce pela adição de conchas de novas células de fibra sobrepostas às gerações anteriores de fibras^24,25. As células de fibra têm uma forma de seção transversal hexagonal alongada com dois lados largos e quatro lados curtos. Essas células se estendem do polo anterior ao posterior do cristalino e, dependendo da espécie, as fibras do cristalino podem ter vários milímetros de comprimento. Para suportar a estrutura dessas células alongadas e magras, interdigitações especializadas ao longo dos lados largos e curtos criam estruturas interligadas para manter a forma da lente e as propriedades biomecânicas. Alterações na forma da membrana celular durante a diferenciação e maturação das células fibrosas têm sido extensivamente documentadas por estudos de microscopia eletrônica (ME)2,3,4,5,6,7,8,9,10,20,26,27,28,29 . As células de fibra recém-formadas têm bolas e soquetes ao longo de seus lados largos com saliências muito pequenas ao longo de seus lados curtos, enquanto as fibras maduras têm saliências e pás interligadas ao longo de seus lados curtos. As fibras nucleares exibem interdigitações de língua e sulco e morfologia da membrana globular. Pouco se sabe sobre as proteínas necessárias para essas complexas membranas interligadas. Estudos prévios sobre a localização de proteínas em células fibrosas basearam-se em cortes de tecido do cristalino, que não permitem uma visualização clara da arquitetura celular complexa.

Este trabalho criou e aperfeiçoou um novo método para fixar células de fibras simples e em feixes de lentes para preservar a morfologia complexa e permitir a imunomarcação de proteínas na membrana celular e dentro do citoplasma. Este método preserva fielmente a arquitetura da membrana celular, comparável aos dados de estudos de EM, e permite a coloração com anticorpos primários para proteínas específicas. Temos previamente imunomarcadas fibras corticais do cristalino em fase de diferenciação e^{maturação22,23}. Neste protocolo, há também um novo método para corar células de fibra do núcleo do cristalino. Este protocolo abre as portas para a compreensão dos mecanismos de formação e mudanças nas interdigitações da membrana durante a maturação das células fibrosas e compactação do núcleo do cristalino.