B세포 치료제 연구를 위해 CRISPR/Cas9 및 재조합 아데노 관련 바이러스 혈청형 6을 이용하여 일차 붉은털원숭이 B세포를 배양하고 유전자를 편집하는 방법을 제시합니다.
B 세포와 그 자손은 고도로 발현된 항체의 공급원입니다. 풍부한 단백질, 말초 혈액을 통한 쉬운 접근성, 간단한 입양 이식에 대한 접근성과 함께 높은 단백질 발현 능력은 재조합 항체 또는 기타 치료 단백질을 발현하기 위한 유전자 편집 접근법의 매력적인 표적이 되었습니다. 마우스 및 인간 일차 B 세포의 유전자 편집은 효율적이며 생체 내 연구를 위한 마우스 모델은 가능성을 보여주었지만 더 큰 동물 모델에 대한 타당성과 확장성은 지금까지 입증되지 않았습니다. 따라서 우리는 이러한 연구를 가능하게 하기 위해 시험관 내에서 붉은털 원숭이 일차 B 세포를 편집하는 프로토콜을 개발했습니다. 우리는 CRISPR/Cas9를 사용하여 말초 혈액 단핵 세포 또는 비장 세포에서 일차 붉은털 원숭이 B 세포의 시험관 내 배양 및 유전자 편집 조건을 보고합니다. 대형(<4.5kb) 카세트의 표적 통합을 달성하기 위해 테트라사이클린 활성화 자가 침묵 아데노바이러스 헬퍼 벡터를 사용하여 상동성 지향 복구 템플릿으로 재조합 아데노 관련 바이러스 혈청형 6을 준비하기 위한 빠르고 효율적인 프로토콜이 포함되었습니다. 이러한 프로토콜을 통해 붉은털 원숭이의 전향적 B 세포 치료제를 연구할 수 있습니다.
B 세포는 체액 면역의 기초입니다. 동족 항원과 2차 신호에 의해 활성화되면 나이브 B 세포는 배중심 B 세포, 기억 B 세포 및 형질 세포를 생성합니다1. 후자는 현재 이용 가능한 대부분의 백신의 보호 기능을 매개하는 분비 항체의 공급원이다2. 형질세포는 혈청 내에서 약 2 ng/day/cell3에 달하는 방대한 양의 항체를 분비하며, 이는 혈청 내 7-16 g/L 혈청에 달하는 항체를 가장 풍부한 세 가지 단백질 중 하나로 만들기 때문에 항체 공장으로 알려져 있습니다4. B 세포는 혈액이 풍부하므로 쉽게 얻을 수 있고 개인에게 다시 주입 할 수 있습니다.
이러한 특성으로 인해 B 세포는 B 세포 수용체(BCR)를 유전자 편집하고 인간 면역결핍 바이러스(HIV)5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 및 기타 단백질에 대한 광범위한 중화 항체(bNAbs)를 발현하기 위한 세포 치료 노력의 표적이 되었습니다 16, 17,18,19,20,21. 이러한 접근법은 생체 내 수많은 마우스 연구에서 잠재력을 보여주었습니다 7,8,10,11,16,22. 그러나 임상 번역 9,15,23을 위해서는 여전히 몇 가지 장애물을 극복해야 하며, 그 중 안전성, 지속 기간 및 치료 효능의 크기뿐만 아니라 비인간 영장류(NHP)와 같은 더 큰 동물로의 스케일링도 포함됩니다. 실제로, NHP, 특히 항체 및 HIV 연구24,25에서 오랜 역사를 가진 붉은털 원숭이는 이러한 매개 변수를 테스트하는 데 가장 적합한 모델입니다.
여기에서 우리는 이러한 문제를 해결할 수 있는 프로토콜을 개발했습니다. 현재까지, 붉은털원숭이 B 세포를 생체 외에서 배양하려는 연구는 거의 없었고, 붉은털원숭이 B 세포의 정제에 대해 CD20을 사용한 양성 선택만이 보고되었다26,27,28. 우리는 다른 세포 유형의 음성 고갈에 의해 손대지 않은 붉은털 원숭이 B 세포를 분리하기 위한 프로토콜을 확립했습니다. 또한, 배양 조건은 붉은털 원숭이 B 세포의 표적 유전자 편집을 위해 정의됩니다. 이 프로토콜은 배양된 붉은털 원숭이 B 세포를 유전자 편집하기 위한 상동성 지향 복구 템플릿(HDRT)으로 CRISPR/Cas9 리보핵단백질(RNP) 및 재조합 아데노 관련 바이러스 혈청형 6(rAAV6)의 사용을 설명합니다. 이 프로토콜을 사용하여 대용량(~1.5kb) 인서트로 최대 40%의 편집 효율성을 달성했습니다. 우리는 또한 테트라사이클린 활성화, 자가 침묵 아데노바이러스 도우미29를 사용하여 rAAV6를 생산하는 빠르고 비용 효율적인 방법을 제시하여 이 형식에서 HDRT의 빠른 테스트를 가능하게 합니다. 이러한 프로토콜은 붉은털 원숭이 B 세포의 유전자 편집을 위한 효율적인 워크플로우를 설명하여(그림 1) NHP 모델에서 B 세포 요법을 평가할 수 있습니다.
실험을 시작하기 위해 기증자 재료는 상업적 출처에서 주문하거나 정맥 절개술 또는 비장 절제술로 얻을 수 있습니다. 이 연구에서, 정맥 절개술 및 혈액 수집은 항응고제 EDTA를 사용하여 앞서 기술한 바와 같이 수행되었다30 . 비장성, 원발성 붉은털원숭이 B 세포를 얻기 위해 이전에 보고된 기술을 사용하여 부분(25%-50%) 또는 전체 비장 절제술을 시행했습니다31. 동물들은 수술 전에 밤새 금식하였다. 간단히 말해서, 수술 중에 복부를 잘라내어 클로르헥시딘과 70% 이소프로필 알코올을 번갈아 가며 세 번 문질러 준비했습니다. 비장을 확인하고 분리하기 위해 복부에 절개 (5-10cm)가 이루어졌습니다. 비장의 혈관 구조는 봉합사 또는 혈관 클램프로 결찰되었습니다. 절개 부위는 4-0 PDS 폴리디옥사논 봉합사로 2층으로 봉합되었습니다. 비장 절제술은 개별 동물에 대해 한 번 수행되었습니다. 단세포 현탁액은 세포 여과기를 통한 침용에 의해 원숭이 비장으로부터 제조되었습니다. 혈액 및 비장 세포 현탁액으로부터의 단핵 세포는 밀도 구배 원심분리를 사용하여 제조되고 액체 질소에 저장되었다.
여기에 제시된 프로토콜은 HDRT로서 rAAV6의 높은 수율과 역가를 생성하는 빠르고 효율적인 방법과 시험관 내에서 1차 붉은털 원숭이 B 세포를 효율적으로 유전자 편집하는 새로운 방법을 제공합니다.
rAAV6 생산 프로토콜은 비교적 간단하고 빠르기 때문에 과도한 노동없이 다양한 구조물을 동시에 생산하고 테스트 할 수 있습니다. 원한다면, rAAV6은 완충액 교환 및 농축 전에 요오드옥사놀 구배 초원심분리(34 ) 또는 수성 2상 분할(35 )과 같은 확립된 프로토콜을 사용하여 추가로 정제할 수 있다.
전체 수율이 감소했지만, 대부분의 rAAV6가 배지36으로 방출되고 세포 펠릿에서 정제하는 데 더 많은 비용과 노동력이 추가되기 때문에 세포 펠릿에서 정제하는 대신 rAAV6 정제를 위해 혈청 환원 세포 배양 배지만 사용하기로 결정했습니다. 자가 비활성화 아데노바이러스 헬퍼를 사용하면 평균 수율이 30-40배 증가하여 단일 15cm 접시에 AAV6으로 포장된 구조물을 테스트할 수 있습니다. 우리의 정제 방법은 기본적이지만 이 방법을 사용하면 다양한 세포주 또는 기타 1차 세포를 사용하여 형질도입 후 유전자 편집 효율 또는 세포 생존율에서 배치 간 변동이 상대적으로 적습니다(데이터는 표시되지 않음).
우리는 바람직하지 않은 집단의 음성 고갈을 사용하여 손대지 않은 1차 B 세포를 얻기 위해 붉은털 원숭이 B 세포 정제 프로토콜을 개발했습니다. 이들 세포를 유전자 편집하는 데 필요한 것은 아니지만, 다른 세포 유형이 실험 목표를 방해하는 경우 이 응용 분야 또는 다른 적용을 위해 1차 붉은털 원숭이 B 세포의 비교적 순수한 집단을 얻을 수 있는 방법을 제공합니다. 그러나 순도는 전체 B 세포 수율을 감소시키는 대가를 치르게 됩니다. 특히, 농축 및 비농축 B 세포 배양 모두에서 초기 PBMC 또는 비장세포 제제에서 B 세포의 분획이 중요합니다. 특히 PBMC의 경우, 이 값은 개인마다 크게 다를 수 있으므로 실험을 위해 많은 수의 B 세포를 얻기 위해 말초 혈액에서 B 세포 비율이 높은 개인에 대해 다른 원숭이를 선별하는 것이 좋습니다27. PBMC는 규칙적인 출혈 또는 백혈구 성분채집술에 의해 얻어질 수 있다42.
유전자 편집 프로토콜은 일반적으로 녹아웃의 60%-80%와 녹인 B 세포의 5%-20% 사이에서 효율적인 유전자 편집으로 이어지지만, 최대 90%의 BCR 녹아웃 및 40%의 BCR 녹인 B 세포를 달성했습니다(그림 5 및 그림 6).
붉은털원숭이 B 세포의 효율적인 편집을 위한 주요 파라미터는 sgRNA의 절단 효율, 전기천공 파라미터, MOI 및 rAAV6 제제의 품질입니다. 후보 sgRNA의 절단 효율은 HDRT의 최적 편집 및 설계를 허용하기 위해 경험적으로 결정되어야 합니다. 여기에 제시된 전기천공 파라미터는 효율성과 생존 가능성의 균형을 유지하여 편집된 B 세포의 가장 높은 비율이 아닌 편집된 B 세포의 최대 총 수를 얻습니다. 더 높은 비율의 편집된 셀이 필요한 경우 더 많은 세포 사멸이 관찰될 수 있지만 증가된 전압(최대 1,750V) 또는 변경된 펄스 길이(10-30ms)가 권장됩니다. 우리는 또한 동일한 개인의 PBMC의 B 세포에 비해 비장 B 세포에서 약간 더 높은 편집 효율을 발견했습니다(그림 5). 그러나 이에 대한 근본적인 이유는 현재 알려져 있지 않습니다.
우리는 전기천공 후 1% DMSO를 첨가하면다른 세포의 보고와 일치하여 세포 생존율에 영향을 미치지 않으면서 붉은털 원숭이 B 세포에서 유전자 편집 효율이 ~40%까지 유의하게 증가한다는 것을 발견했습니다(그림 6A-C). 그러나 1% DMSO에서 장기간 배양하는 것은 피해야 하며 세포 생존력에 영향을 미칠 수 있습니다. 원하는 경우 DMSO를 완전히 생략할 수 있습니다.
rAAV6와 함께 몇 시간 동안 전기천공한 후 소량의 세포 배양은 아마도 rAAV6에 의한 HDRT의 더 나은 형질도입으로 인해 더 높은 편집 효율을 가져오고, 따라서 Cas9이 활성화되는 해당 시간에 HDRT의 세포 내 농도가 더 높기 때문일 것입니다. 이러한 방식으로 최대 8시간 동안 세포를 배양해도 세포 생존율에 영향을 미치지 않았지만 편집 효율은 5시간 이상 크게 증가하지 않았습니다(그림 6). knock-in 대신 knock-out만 필요한 경우 이 단계를 생략할 수 있습니다.
결론적으로, 우리는 시험관 내에서 붉은털 원숭이 B 세포의 유전자 편집 및 원하는 구성물의 효율적인 knock-in에 필요한 rAAV6 HDRT의 생산을 위한 포괄적인 프로토콜을 제시합니다. 이러한 프로토콜을 통해 rAAV6로 패키징된 많은 구조물을 빠르고 비용 효율적으로 테스트할 수 있으며 보다 관련성이 높은 비인간 영장류 모델에서 B 세포 요법의 타당성 및 확장성에 대한 전임상 테스트를 수행할 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
RC1 항원을 제공한 Harry B. Gristick과 Pamela Bjorkman과 비판적인 토론을 위해 전체 Nussenzweig 및 Martin 실험실에 감사드립니다. 이 연구는 빌 앤 멜린다 게이츠 재단 보조금 INV-002777 (MCN에) 및 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 국립 알레르기 및 전염병 연구소 (National Institute of Allergy and Infectious Diseases)의 교내 연구 프로그램 (Intramural Research Program)의 지원을 받았다. (R.G. 및 M.A.M). MCN은 HHMI 조사관입니다.
1.5 mL tube sterile, Dnase, Rnase and purogen free | Stellar Scientific | T17-125 | or similar |
10 mL serological pipette, polystyrene, sterile, nonpyrogenic, DNase-/RNase-free, and Human DNA-free | Corning | 4488 | or similar |
15 cm tissue culture dish | Falcon | 353025 | or similar |
15 mL polypropylene conical tybe | Falcon | 352097 | or similar |
25 mL serological pipette, polystyrene, sterile, nonpyrogenic, DNase-/RNase-free, and Human DNA-free | Corning | 4489 | or similar |
250 mL polypropylene conical tybe | Corning | 430776 | or similar |
293AAV cell line | Cell Biolabs | AAV-100 | |
2-B-mercapto-ethanol, 55mM (1000x) | Gibco | 21985-023 | |
48-well tissue culture plate | Corning | 3548 | or similar |
5 mL serological pipette, polystyrene, sterile, nonpyrogenic, DNase-/RNase-free, and Human DNA-free | Corning | 4487 | or similar |
5 mL syringes with Luer-Lok Tip | BD | 309646 | or similar |
50 mL polypropylene conical tybe | Falcon | 352070 | or similar |
50 mL serological pipette, polystyrene, sterile, nonpyrogenic, DNase-/RNase-free, and Human DNA-free | Corning | 4490 | or similar |
6-well tissue culture plate | Falcon | 353046 | or similar |
AAV-6 Packaging System (plasmids) | Cell Biolabs | VPK-406 | |
AAV6 Reference Materials (full capsids) | Charles River | RS-AAV6-FL | |
Accu-jet S Pipette Controller | Brand | 26350 | or similar pipette controller |
Antibiotic/Antimycotic 100x | Gibco | 15260-062 | |
anti-human CD14 AlexaFluor647 | Biolegend | 301812 | |
anti-human CD14 biotin | BioLegend | 301826 | |
anti-human CD16 AlexaFluor700 | BD Biosciences | 557920 | |
anti-human CD16 biotin | BioLegend | 302004 | |
anti-human CD20 PECy7 | Biolegend | 302312 | |
anti-human CD3 biotin | Thermo Fisher | APS0309 | |
anti-human CD3 PE | BD Biosciences | 552127 | |
anti-human CD33 biotin | Miltenyi | 130-113-347 | |
anti-human CD64 biotin | BioLegend | 305004 | |
anti-human CD66 biotin | Miltenyi | 130-100-143 | |
anti-human CD89 biotin | BioLegend | 354112 | |
anti-human CD8a biotin | BioLegend | 301004 | |
anti-human HLA-DR BV605 | Biolegend | 307640 | |
anti-human Ig light chain lambda APC | Biolegend | 316610 | |
anti-human IgM BV421 | Biolegend | 314516 | |
anti-Human Kappa Light Chain FITC | Fisher Scientific | A18854 | |
Autoclave | Steris | Amsco Lab 250 | or similar |
Cell culture CO2 incubator | Fisher Scientific | 51026331 | or similar |
Centrifugal Filter Unit (Amicon Ultra – 4, 100 kDa) | Millipore | UFC810024 | |
Centrifuge 5920 R | Eppendorf | EP022628188 | or any other, coolable swinging bucket centrifuge with inserts for 96-well plates, 15, 50 and 250 mL size tubes |
Chloroform | Fisher Scientific | C298SK-4 | |
Cpg ODN | Invivogen | tlrl-2395 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 34869-500ML | |
DMEM, High Glucose | Gibco | 11965092 | |
DNaseI (RNase-free) | New England Biolabs | M0303L | |
DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | |
Electroporation kit (Neon Transfection System 10 µL) | Fisher Scientific | MPK1096 | or other sizes or 100 uL transfection kit MPK 10096 |
Electroporation system (Neon Transfection System) | Fisher Scientific | MPK5000 | |
FCS | Hyclone | SH30910.03* | |
Ficoll-PM400 (Ficoll-Paque PLUS) | Cytiva | 17144002 | or similar |
Fume Hood | Fisher Scientific | FH3943810244 | or similar |
Glutamine 200 mM | Gibco | 25030-081 | |
Graduated Cylinder 1L | Corning | 3022-1L | or similar |
Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z375357-1EA | or similar |
HEPES 1M | Gibco | 15630-080 | |
HEPES 1M | Gibco | 15630-080 | |
Hot Plate Magnetic Stirrer | Fisher Scientific | SP88857200 | or similar |
Human BAFF | Peprotech | 310-13 | |
Human BD Fc Block | BD | 564220 | |
Human IL-10 | Peprotech | 200-10 | |
Human IL-2 | Peprotech | 200-02 | |
Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
Hydrophilic Polyethersulfone Syringe Filters, (Supor membrane), Sterile – 0.2 µm, 25 mm | Pall | 4612 | |
Insulin-Transferin-Selenium, 100x | Gibco | 41400-045 | |
ITR primer forward: GGAACCCCTAGTGATGGAGTT | Integrated DNA Technologies | custom | |
ITR primer reverse: CGGCCTCAGTGAGCGA | Integrated DNA Technologies | custom | |
Laminar flow biosafety cabinet | The Baker Company | SG403A | or similar |
Large magnetic depletion (LD) Column | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
Magentic seperator (MidiMACS separator and multistand) | Miltenyi Biotec | 130-090-329 | |
Magnetic stir bar | Fisher Scientific | 14-512-127 | or similar |
Magnetic streptavidin beads (Streptavidin MicroBeads) | Miltenyi Biotec | 130-048-101 | |
Maxiprep kit | Machery-Nagel | 740414.5 | or similar |
Media Bottles 2L with cap | Cole-Parmer | UX-34514-26 | or similar |
MegaCD40L | Enzo | ALX-522-110-C010 | |
MicroAmp Optical 384-well Reaction Plate | Fisher Scientific | 4309849 | |
MicroAmp Optical Adhesive Film | Fisher Scientific | 4311971 | |
Microcentrifuge 5424 R | Eppendorf | 5404000014 | or any other table top centrifuge for 1.5 mL tubes |
Microwave oven | Panasonic | NN-SD987SA | or similar |
Nikon TMS Inverted Phase Contrast Microscope | Nikon | TMS | or any other Inverted phase-contrast microscope for cell culture |
Non-essential amino acids, 100x | Gibco | 11140-050 | |
Nuclease-free Duplex buffer | Integrated DNA Technologies | 11-01-03-01 | |
Nuclease-free Water | Qiagen | 129115 | |
pH meter | Mettler Toledo | 30019028 | or similar |
Pipetman Classic Starter Kit, 4 Pipette Kit, P2, P20, P200, P1000 and tips | Gilson | F167380 | or similar set of pipettes and tips |
Pluronic F-68 10 % | Gibco | 24040-032 | |
Polyethylene Glycol 8000 | Fisher Scientific | BP233-1 | |
Polyethylenimine, Linear, MW 25000, Transfection Grade (PEI 25K | Polysciences | 23966-100 | |
Precision Balance | Mettler Toledo | ME4001TE | or similar |
Pre-Separation Filters (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
Pyrex glass beaker 2 L | Cole-Parmer | UX-34502-13 | or similar |
Pyrex glass beaker 250 mL | Millipore Sigma | CLS1000250 | or similar |
qPCR Instrument | Fisher Scientific | 4485691 | or similar |
RC1 antigen randomly biotinylated | Bjorkman lab, CalTech | in house | |
RPMI-1640 | Gibco | 11875-093 | |
S.p. Cas9 Nuclease | Integrated DNA Technologies | 1081059 | |
Scientific 1203 Water Bath | VWR | 24118 | or any water bath set to 37 °C |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653-5KG | |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045-500G | |
Sodium Pyruvate 100 mM | Gibco | 11360-070 | |
Sterile Disposable Filter Units with PES Membranes | Thermo Scientific Nalgene | 567-0020 | |
Streptavidin-PE | BD Biosciences | 554061 | |
SYBR Green Master Mix | Fisher Scientific | A25742 | |
Tetracycline-enabled, self-silencing adenoviral vector RepCap6 | Oxgene | TESSA-RepCap6 | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300054 | |
Water Purification System | Millipore Sigma | ZEQ7000TR | or similar |
Zombie-NIR | Biolegend | 423106 |