עריכה גנטית של תאי Rhesus Macaque B ראשוניים

כל ההליכים והניסויים בבעלי חיים בוצעו על פי פרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות, המכונים הלאומיים לבריאות. סיכום הפרוטוקולים הבאים מוצג באיור 1. קופי מקוק רזוס זכרים ונקבות (Macaca mulatta) ממוצא גנטי הודי בגילאי 2-8 שנים שוכנו וטופלו בהתאם להנחיות הוועדה לטיפול ושימוש בחיות מעבדה במתקן ברמת בטיחות ביולוגית 2. זהירות: כל הניסויים בוצעו בהתאם לאמצעי הזהירות האוניברסליים לפתוגנים הנישאים בדם, עם טכניקות סטריליות/אספטיות וציוד בטיחות ביולוגית מתאים ברמה 2 במנדפים של זרימה למינרית. 1. ייצור rAAV6 הכן את הריאגנטים לייצור rAAV6.תכנן ושכפל את תבנית התיקון מכוונת ההומולוגיה בין חזרות המסוף ההפוכות (ITR) של AAV2 ב- pAAV הווקטורי באמצעות טכניקות סטנדרטיות. ודא שזרועות ההומולוגיה הן לפחות ~ 250 bp מכל צד, אך רק 60 bp עשוי להספיק, אם כי זרועות הומולוגיה ארוכות יותר עדיפות אם עיצוב המבנה מאפשר זאת. אם רצפי מטרה של אחד מה-sgRNA המשומשים נמצאים ב-HDRT, הסירו אותם באמצעות מוטציות שקטות, שהן היעילות ביותר במוטיב הפרוטוספייסר הסמוך או באזור הזרעים של אתר המטרה.הערה: ניתן לבצע סינתזת גנים בשילוב עם הרכבת גיבסון לשיבוט יעיל32. הכן Maxiprep של שיבוט נכון עבור transfection. עבור תכנון sgRNA, מומלץ CHOPCHOP33, ורשימה של כלים נוספים ניתן למצוא בכתובת https://zlab.bio/guide-design-resources. קיבולת האריזה המרבית עבור AAV כולל ITR היא ~ 4.7 kb. AAV6 הוא הסרוטיפ הנפוץ ביותר לעריכת תאים המטופויטיים, במיוחד תאי B9. סרוטיפים אחרים של AAV לעריכה גנטית של תאי Rhesus macaque B לא נבדקו, אך AAV28 ו- AAV-DJ10,11 שימשו במחקרי עכברים. הכינו מדיום תרבית 293AAV ומדיום ייצור לפי טבלה 1 וטבלה 2. מסנן סטרילי דרך יחידת מסנן קרום פוליאתרסולפון (PES) 0.2 מיקרומטר. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C. הכינו תמיסת פוליאתילנימין (PEI) 1x (1 מ”ג/מ”ל, 100 מ”ל). בכד זכוכית של 250 מ”ל, מחממים ~ 70 מ”ל של H2O במיקרוגל למשך ~30 שניות, ולאחר מכן מוסיפים 100 מ”ג PEI. מוסיפים מערבל מגנטי ומערבבים עד שה-PEI מומס ברובו. כוונן את ה- pH ל- 7 עם 1 M HCl, ולאחר מכן מלא עד 100 מ”ל עם H2O, המתן 10 דקות, בדוק שוב את ה- pH וכוונן במידת הצורך. סנן סטרילי את תמיסת PEI דרך יחידת מסנן קרום PES של 0.2 מיקרומטר, aliquot ואחסון -20°C. לאחר ההפשרה, ניתן לאחסן את התמיסה ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד חודשיים. הכינו תמיסת 5x פוליאתילן גליקול (PEG)/NaCl. שוקלים 400 גרם PEG 8,000 ו-24 גרם NaCl. הוסיפו מערבל מגנטי לכוס זכוכית בנפח 2 ליטר, הוסיפו את ה-PEG 8,000 וה-NaCl ושטפו ב~550 מ”ל מים נטולי יונים. מערבבים עם חימום, ומביאים לרתיחה או 80-90 מעלות צלזיוס עד להמסה מלאה. כוונן את ה- pH ל~ 7.4 עם 1 M NaOH, ולאחר מכן כוונן את עוצמת הקול ל- 1 L באמצעות גליל מדידה, והעבר אותו לבקבוק זכוכית 2 L עם המערבל המגנטי. הוציאו את הבקבוק, הבוחש המגנטי והתמיסה באמבט מים למשך 30 דקות בטמפרטורה של 121°C. לאחר האוטוקלאבינג, קררו את התמיסה בחדר קר תוך כדי ערבוב באמצעות המערבל המגנטי למניעת הפרדה לפאזות שונות. Aliquot במידת הצורך, ולאחסן ב 4 °C. הכן את מאגר הניסוח. ערבבו 500 מ”ל של DPBS עם 50 μL של 10% F-68 פלורוני. יש לסנן סטרילי דרך יחידת מסנן קרום PES בגודל 0.2 מיקרומטר, ולאחסן בטמפרטורת החדר (RT). תרבית תאים, טרנספקציה והתמרה לייצור rAAV6הפשרה, תרבית והקפאה של תאי 293AAV כמתואר על ידי היצרן באמצעות מדיום התרבית 293AAV לעיל וטריפסין-EDTA לפיצול. מומלץ להקפיא כמה מעברים מוקדמים ולהשתמש בתאים לייצור AAV לפני שהם מגיעים למעבר 40. לייצור rAAV6, זרעו ארבע צלחות תרבית תאים בקוטר 15 ס”מ עם 5 x 106 תאים ב-30 מ”ל כל אחת. התאים מוכנים לטרנספקציה בדרך כלל 1-2 ימים לאחר הזריעה כאשר הם מגיעים למפגש של 80%-90%. הפשירו Maxiprep של פלסמיד pAAV המכיל HDRT שייארז לתוך AAV6. השהה 85.6 מיקרוגרם של פלסמיד pAAV ב 3 מ”ל של מדיום DMEM טהור. להמיס 342 μL של 1 מ”ג/מ”ל תמיסת PEI ב-3 מ”ל של מדיום DMEM טהור. דגרו על שני הפתרונות למשך 10 דקות ב-RT. מערבבים את שני צינורות 3 מ”ל לצינור אחד של ~ 6.4 מ”ל של תערובת טרנספקציה, ודגרים במשך 20 דקות ב- RT. בינתיים, הפשירו את וקטור העזר RepCap6 התומך בטטרציקלין, התומך בטטרציקלין, מהמקפיא בטמפרטורה של 80°C באמבט מים של 37°C. כדי להתמיר את תאי 293AAV, הוסף את וקטור העזר בריבוי זיהומים (MOI) של 25 באמצעות מינון זיהומי חציוני של תרבית רקמה (TCID 50) ובהנחה של 1.15 x10 7 תאים לצלחת; בדרך כלל, 2-10 μL משמש לכל צלחת 15 ס”מ. נענעו וערבלו את הכלים בעדינות לפיזור. לאחר הדגירה של תערובת transfection, להוסיף 1.6 מ”ל ממנו טיפה על פני כל אחד מארבעת הכלים 15 ס”מ. יש לדגור על 37°C ו-5% CO2 למשך הלילה.הערה: לחלופין, אם וקטורי rAAV6 המעניינים כבר זמינים, ניתן להשתמש בווקטורים אלה כדי לספק את הגנום הנגיפי שיש לארוז, מה ששולל את הצורך בפלסמידים כלשהם עם מערכת זו ומניב טיטרים rAAV6 דומים. עבור גישה זו, תאי 293AAV מומרים יחד עם rAAV6 הרצוי ב- MOI של 50 (מבוסס על עותקי גנום rAAV6 [GC]/mL) יחד עם וקטור המסייע. למחרת, בזהירות לשאוף ולהשליך את מדיום התרבית, ולהחליף עם 30 מ”ל של מדיום ייצור מחומם מראש. דוגרים עוד 96 שעות לפני הקציר. לא מומלץ שינוי בינוני נוסף כדי למקסם את התשואות. קציר וטיהור של AAV6 רקומביננטי מן המדיוםמבלי לנתק תאים מהצלחת, אספו את כל הסופרנאטנט של התא ליחידת סינון עם קרום PES של 0.2 מיקרומטר הגדול לפחות ב-50% מנפח המדיום שיש לסנן. לאחר מכן, סנן את supernatant.הערה: אם רוצים יבולים גבוהים יותר של rAAV6, ניתן לקצור את התאים ולחלץ את ה-rAAV מכדורית התא באמצעות ערכות מסחריות או פרוטוקולים מבוססים34,35. מכיוון ש-AAV6 מופרש ברובו לתווך36, נעשה שימוש רק בסופרנאטנט, מה שהפחית את העבודה, העלות והזמן. הוסף תמיסת 5x PEG/NaCl לסופרנאטנט המסונן ב-25% מהנפח שנאסף; זה בדרך כלל 30 מ”ל אם ארבעה כלים 15 ס”מ של 30 מ”ל משמשים. מערבבים היטב על ידי היפוך, ולאחר מכן לדגור לילה ב 4 °C כדי לזרז את החלקיקים הנגיפיים.הערה: חלקיקי AAV יציבים עד יומיים בתמיסה זו. מקררים מראש צנטריפוגת דלי נדנדה עם 250 מ”ל של תוספות צינור ל -4 מעלות צלזיוס. הכינו יחידת מסנן צנטריפוגלית של 4 מ”ל עם חיתוך של 100 kDa ומסנן מזרק PES הידרופילי של 0.22 מיקרומטר על ידי טיפול מקדים בכל ממברנה עם 2 מ”ל של 10% F-68 פלורוני למשך שעה לפחות אחת ב-RT. מעבירים את תערובת AAV-PEG/NaCl לתוך צינור בנפח 250 מ”ל, צנטריפוגה בטמפרטורה של 2,500 x גרם למשך שעה אחת ב-4°C, ולאחר מכן מסירים בזהירות את כל הסופרנאטנט בשאיפה. יש להשהות מחדש את הגלולה הנגיפית בצבע בז’ ללבן על ידי ערבול של 4 מ”ל של 1 M HEPES עד להשעיה מלאה. במידת הצורך, תן לו לעמוד במשך 5 דקות, מערבול שוב. השהה מחדש באמצעות פיפטה סרולוגית 5 מ”ל, ולהעביר את הנפח הכולל לתוך צינור 15 מ”ל. במכסה אדים, הוסיפו נפח שווה של כלורופורם לתרחיף הנגיף – בדרך כלל 4 מ”ל. מערבל במרץ במשך 2 דקות, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 1,000 x גרם במשך 5 דקות ב RT. אספו את השכבה העליונה (סופרנאטנט המכיל AAV) בצינור חדש של 50 מ”ל, והשליכו את השכבה התחתונה (כלורופורם).זהירות: תמיסות המכילות כלורופורם הן פסולת מסוכנת. פעל בהתאם להנחיות המוסדיות לסילוקו. מניחים את הסופרנאטנט המכיל AAV מתחת למכסה אדים, ונותנים לכלורופורם הנותר להתאדות למשך 30 דקות. בינתיים, לשטוף את יחידת המסנן הצנטריפוגלי מראש מסנן מזרק. הוסף 1.5 מ”ל של חיץ ניסוח ליחידת המסנן הצנטריפוגלי שטופלה מראש. צנטריפוגה במהירות 3,500 x גרם למשך 10 דקות ב-15°C ברוטור דלי מתנדנד. חזור על שלב זה עם 4 מ”ל של חיץ ניסוח כדי לשטוף את הממברנה. שטפו את מסנן המזרק פעמיים עם 5 מ”ל של חיץ פורמולציה באמצעות מזרק 5 מ”ל. טען את ~4 מ”ל של סופרנאטנט המכיל AAV ממיצוי הכלורופורם לתוך מזרק 5 מ”ל, חבר את מסנן המזרק השטוף וסנן ישירות ליחידת המסנן הצנטריפוגלי. צנטריפוגה בטמפרטורה של 3,500 x גרם למשך 25 דקות ב-15°C, ולאחר מכן אשרו שתמיסת ה-AAV במסנן היא בסביבות 50-100 μL. אם נפח התמיסה הוא >100 μL, המשך לצנטריפוגה. לאחר הסרת התסנין, מוסיפים 4 מ”ל של חיץ פורמולציה בתוך יחידת המסנן הצנטריפוגלי, ומערבבים את התמיסה באופן אחיד על ידי פיפט. צנטריפוגה ב 3,500 x גרם במשך 25 דקות ב 15 ° C, ולאחר מכן לאשר כי פתרון AAV במסנן הוא בין 50-100 μL. אם נפח התמיסה הוא >100 μL, המשך לצנטריפוגה. חזור על שלב זה לשטיפה נוספת. לאחר הצנטריפוגה הסופית, לאשר את נפח הפתרון הוא 50-70 μL; אם לא, המשיכו לצנטריפוגה. מעבירים את התכשיר לצינור של 1.5 מ”ל. Aliquot אם תרצה, ולאחסן ב -80 ° C. קביעת טיטר רקומביננטי AAV6 על ידי qPCRהערה: פריימרים qPCR anneal באזור ITR וצריך, לכן, להיות מתאים לכל המבנים המשוכפלים לתוך pAAV.הפשיר aliquot של rAAV6 להיות titered ו aliquot של חומר עזר AAV6. חומר הייחוס AAV6 צריך להיות קרוב ל 4 x 1011 GC / mL; אחרת, התאימו את הדילולים בהתאם. בצע DNase I digest כדי להסיר כל DNA פלסמיד חופשי שנותר בהכנת rAAV6 על ידי שילוב של 2.0 μL של הדגימה או חומר ייחוס AAV6 עם 15.6 μL של H 2 O נטול נוקלאז,2.0μL של 10x DNase I חוצץ, ו 0.4 μL של DNase I. מערבבים ודוגרים בעדינות במשך 30 דקות ב-37°C ולאחר מכן מעבירים לקרח. זהו דילול 1 (ראה טבלה 3). הכינו דילול סדרתי פי חמישה של כל הדגימות וחומר הייחוס AAV6 כמו בטבלה 3 להלן עם מים. הכינו תערובת מאסטר qPCR ירוקה של SYBR. בכל באר, יש לערבב 4.7 μL של מים נטולי נוקלאז עם 10 μL של תערובת מאסטר SYBR Green, 0.15 μL של פריימר ITR קדימה ב-100 μM, ו-0.15 μL של פריימר ITR הפוך ב-100 μM.הערה: כל דגימה נמדדת בכפילות, עם 16 בארות עבור תקן הייחוס, 8 בארות לכל דגימה ו-2 בארות עבור בקרה ללא תבנית. הכינו 10% יותר תערובת מאסטר כדי לקחת בחשבון את שגיאת הפיפט. בלוח תגובה אופטי של 96 בארות או 384 בארות, טען 15 μL / well של תערובת האב qPCR ירוקה של SYBR. לאחר מכן, טען 5 μL של דגימות וחומר ייחוס AAV6 או מים נטולי נוקלאז עבור הבקרה ללא תבנית. עבור תקן הייחוס AAV6, דילול עומס 2 לדילול 9. עבור דגימות, דילול עומס 5 לדילול 8. למדוד כל דילול בכפילות. הימנעו מבועות. אטמו את הצלחת הטעונה בסרט אופטי שקוף, צנטריפוגה ב 800 x גרם למשך דקה אחת ב- RT, וטענו את הצלחת למכשיר qPCR עם ההתקנה המתאימה של 96 באר או 384 בארות. הגדר והפעל את מכשיר qPCR באמצעות זיהוי SYBR עם תנאי המחזור הבאים: 98 ° C למשך 3 דקות, ולאחר מכן 40 מחזורים של 98 ° C עבור 15 שניות ו- 58 ° C במשך 30 שניות, ולאחר מכן עקומת התכה. נתח את הנתונים באמצעות תוכנת המכשיר תוך שימוש בריכוז חומר הייחוס AAV6 בעותקי גנום למילימטר (GC/mL) כעקומה הסטנדרטית (ראה טבלה 3). חישוב הריכוז הסופי של הדגימה על ידי הכפלה בגורם הדילול. ודא שהעקומה הסטנדרטית R2 קרובה ל -1.0, יעילות ה- PCR היא 90%-110%, קו הבסיס הוסר, עקומת ההיתוך מראה שיא יחיד, ערכי C t משתנים בהתאם לדילולים, והכפילויות הן בטווח של 0.5 Ct; אחרת, לא לכלול חריגים. צפו לתשואות כמו באיור 2. 2. הכנת מדיה וגירויים של תאי B הכן אמצעי הפשרה: שלב RPMI-1640 עם 20% FCS. מסנן סטרילי דרך יחידת מסנן קרום PES בגודל 0.2 מיקרומטר. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C. הכן מדיום תרבית תאי B: שלב את הריאגנטים בטבלה 4, ולאחר מכן סנן סטרילי דרך יחידת מסנן קרום PES של 0.2 מיקרומטר. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C. השהה מחדש כל אחד מממריצי תאי B בטבלה 5 בריכוזי מלאי בתווך תרבית תאי B, למעט CpG ODN שיש להשהות מחדש במים נטולי נוקלאז. יש לאחסן בטמפרטורה של -80°C. אם אתם מבצעים דלדול שלילי של תאי B שאינם תאי B (שלב 4 אופציונלי), הכינו DPBS (ללא סידן, ללא מגנזיום) עם 2% FCS (DPBS 2% FCS). מסנן סטרילי דרך יחידת מסנן קרום PES בגודל 0.2 מיקרומטר. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C. 3. הכנה ותרבית של תאי מקוק רזוס B הערה: PBMCs מקוק רזוס שמור בהקפאה או splenocytes משמשים להגדרת תרבית התא30,31. הפשרה מראש בינונית ותרבית תאי B באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. הפשירו את הממריצים של תאי B מטבלה 5 על קרח. הכינו צינור בגודל מתאים המכיל אמצעי הפשרה שחומם מראש. זה צריך להיות באופן אידיאלי יותר מ 10 פעמים נפח של תאים מופשרים. הפשיר אחד או שניים cryovials של PBMCs או splenocytes בכל פעם באמבט מים 37 ° C, ו decant לתוך צינור מוכן עם מדיום שחומם מראש. שטוף את cryotubes כדי לאסוף את כל התאים. צנטריפוגה את התאים ב 200 x גרם במשך 10 דקות ב RT.הערה: הגדרות צנטריפוגות אלה מפחיתות את זיהום טסיות הדם תוך שמירה על תפוקת PBMC. ניתן להשתמש במהירויות גבוהות יותר כגון 350 x גרם למשך 5 דקות. להשהות את התאים ב 10 מ”ל מדיום הפשרה לשטיפה. חזור על שלב 3.4 ושלב 3.5 עבור סך של שלוש צנטריפוגות כדי להסיר את המדיום המקפיא. לאחר הצנטריפוגה האחרונה, השהה מחדש את התאים ב ~ 5 x 106 תאים / מ”ל בתווך תרבית תאי B.הערה: תרביות הפרוטוקול לעיל מכילות תכשירי PBMC או טחול שלמים עם זיהום על ידי תאים אחרים. אם נדרשות תרביות תאי B טהורות יותר, אם כי בתפוקה הכוללת הכוללת של תאי B מופחתת משמעותית, המשך לשלב 4. לא נצפו הבדלים ביעילות העריכה בין שתי השיטות. לדלל aliquot של 10 μL של תאים לפי הצורך עם מדיום תרבית תא B לספירה. ספירה באמצעות המוציטומטר וצביעה כחולה טריפאן, המשלבת נפחים שווים של תאים מרחפים ותמיסת טריפאן כחולה 0.4%. התאם את ריכוז התא ל 3 x 106 תאים / מ”ל עם מדיום תרבית תאי B בהתאם לספירת התא. לאחר מכן, הוסיפו את הממריצים של תאי B לריכוזים הסופיים שלהם לפי טבלה 5, וערבבו. מעבירים את התאים לצלחת תרבית תאים מתאימה. בסך הכל, מומלץ 0.6 x 10 6-0.7 x 106 תאים/ס”מ2. לדגור על התאים ב 37 ° C עם 5% CO 2 במשך 48 שעות ±2 שעות. 4. דלדול שלילי אופציונלי של תאים שאינם B הערה: התפוקה והטוהר תלויים באחוז הקלט של תאי B בקרב PBMCs, אשר יכול להיות שונה באופן דרסטי בין קופי מקוק רזוס בודדים27. צפה לטוהר של 80%-95%, יעילות של 60% ו- 1 x 10 6-1.5 x 106 תאים מ- 1 x 107 PBMCs. לאחר השטיפה האחרונה (שלב 3.6), השהה מחדש את התאים ב- 1 x 108 תאים/מ”ל ב- DPBS 2% FCS ובלוק Fc אנושי מדולל 1:200. ספירת התאים מבוססת על מספר התאים המופשרים. דגרו במשך 15 דקות על קרח כדי לחסום את קולטני ה-Fc, ולאחר מכן הוסיפו את הנוגדנים הביוטיניליים בטבלה 6. דוגרים עוד 20 דקות על קרח. מלא את הצינור עם DPBS 2% FCS, וסחרור ב 200 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C. השהה מחדש את התאים ב- DPBS 2% FCS ב- 80% מהנפח משלב 4.1 (כלומר, 80 מיקרוליטר לכל 1 x 107 תאים). הוסף חרוזי סטרפטאבידין מגנטיים לתרחיף התא ב-20% מהנפח משלב 4.1 (כלומר, 20 מיקרוליטר חרוזים לכל 1 x 107 תאים). דוגרים על התאים במשך 15 דקות על קרח, ומתסיסים מדי פעם. בינתיים, לכל 1 x 108 תאים, להכין מפריד מגנטי עם עמוד דלדול מגנטי גדול מסנן טרום הפרדה. שטפו את מסנן קדם-ההפרדה ואת העמוד עם 2 מ”ל של DPBS 2% FCS לפי זרימת כוח הכבידה, והשליכו את הזרימה. התקן צינור איסוף של 15 מ”ל.הערה: השימוש בעמודות אחרות כגון עמודות בחירה חיובית או מערכות טיהור חרוזים מגנטיות אחרות עלול להפחית באופן דרסטי את הטוהר. לאחר הדגירה, מלא את התאים ל 0.5 מ”ל עם DPBS 2% FCS אם נפח הוא <0.5 מ"ל. אם עוצמת הקול היא ≥0.5 מ"ל, פשוט המשך. טען את מתלה התא לתוך מסנן טרום ההפרדה על העמודה המוכנה, ולאסוף את הזרימה דרך לתוך צינור 15 מ”ל. יש להקפיד פעמיים על תאי B מועשרים שאינם מאוגדים על-ידי הוספת 1 מ”ל של DPBS 2% FCS למסנן טרום ההפרדה. אספו את התאים הלא קשורים לאותו צינור על ידי זרימת כוח הכבידה.הערה: אלוציה נוספת עשויה להגדיל באופן שולי את התשואה. ניתן להעריך את הטוהר והיעילות על ידי ציטומטריית הזרימה של תאי הקלט, התאים המועשרים והתאים הנשמרים על העמודה. כדי להשיג את התאים השמורים בעמודה, הסר את העמודה מהמגנט ושטוף עם 3 מ”ל של DPBS 2% FCS באמצעות הבוכנה שסופקה. אם תרצה, הערך את הטוהר לפי ציטומטריית זרימה כמו באיור 3 באמצעות ריאגנטים בטבלה 7. צנטריפוגה את תאי B המועשרים ב 200 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C. השהה מחדש את התאים ב ~ 5 x 106 תאים / מ”ל בתווך תרבית תאי B, והמשך בשלב 3.7. 5. עריכת גנים ראשונית של תאי Rhesus macaque B לאחר הפעלת תאי Rhesus macaque B במשך 48 שעות ± 2 שעות, להכין את ריאגנטים אלקטרופורציה ו transduction.DMSO טרום חם, מאגר דופלקס ללא נוקלאז, חיץ T וחיץ E (ערכת אלקטרופורציה של 10 μL) או E2 (ערכת אלקטרופורציה של 100 μL) מערכת האלקטרופורציה ל- RT. הפשירו את הממריצים rAAV6 HDRT ותאי B מטבלה 5 על קרח. השהה מחדש את ה-sgRNA מסוג CRISPR-Cas9 ב-100 מיקרומטר במאגר דו-צדדי. צור מחדש במשך 10 דקות ב- RT, וערבב על ידי ערבול והחלקה. יש לשמור את ה-sgRNA המשוחזר על קרח עד לשימוש. יש לאחסן בטמפרטורה של -80°C.הערה: ניתן לתכנן את CRISPR-Cas9 sgRNA עם כלים מקוונים שונים (ראה 1.1.1) והוא יכול להשתנות באופן דרסטי ביעילות החיתוך שלהם. בדיקה אמפירית של יעילות החיתוך מומלצת באמצעות בדיקות כגון TIDE37 או ICE38. לכל אלקטרופורציה של 10 מיקרוליטר, הכינו 550 מיקרוליטר של מדיום תרבית תאי B עם כל הממריצים מטבלה 5, והוסיפו 1% DMSO. שנה את קנה המידה של הנפחים פי 10 עבור אלקטרופורציות של 100 μL. לחלופין, 10% של מדיום זה יכול להיות מוכן ללא אנטיביוטיקה antimycotic, אשר מגדיל מעט את הכדאיות התא לאחר transfection. לכל אלקטרופורציה של 10 μL, הכינו באר של צלחת תרבית תאים של 48 בארות עם 50 μL של מדיום תרבית תאי B עם ממריצים וללא אנטיביוטיקה-אנטי-מיקוטית, אם משתמשים בה. עבור אלקטרופורציות של 100 μL, פיפטה 500 μL לתוך בארות של צלחת 6 בארות. הוסף rAAV6 HDRT למדיום הבארות, עד 20% מהנפח בבאר. יש לכוון ל-MOIs בטווח של 1 x 10 5-1 x 10 6 בהתבסס על מספר התאים לכל טרנספקציה (10 μL אלקטרופורציה: 5 x 10 5 תאים; 100 μL אלקטרופורציה:5 x 106 תאים) וה-GC בהכנת rAAV6. ריכוזי מלאי rAAV6 גבוהים של 5 x 1013 GC/mL עד 5 x 1014 GC/mL מומלצים להשגת MOI גבוה עם נפחים נמוכים.הערה: MOI נמוך יותר עלול להוביל ליעילות עריכה מופחתת, ו- MOI של 5 x 105 בדרך כלל קרוב ליעילות העריכה המרבית שראינו. לא נצפתה השפעה של MOI משתנה על יכולת הקיום של תאי B. מומלץ לכלול פקדים ללא rAAV6 HDRT, ללא טרנספקציה של RNP וללא שניהם. מחממים מראש את הכלים המוכנים ואת שאר המדיום על ידי העברתם לאינקובטור ב 37 ° C עם 5% CO2. לכל אלקטרופורציה של 10 μL, הכינו 1.15 μL של ריבונוקלאו פרוטאין (RNP): ערבבו 0.4 μL של 61 μM Cas9 עם 0.75 μL של 100 μM sgRNA בחיץ דו-צדדי. הכינו תוספת (מומלץ 30% יותר עבור אלקטרופורציה בודדת) בשל טעות צנרת וכדי למנוע בועות בעת העמסת קצות האלקטרופורציה. יש לשנות קנה מידה פי 10 לקבלת קצוות של 100 μL. יש לדגור על ה-RNP במשך 15 דקות לפחות ב-RT לפני ערבוב עם התאים. לאחר הדגירה, ניתן לשלב מספר RNPs אם יש להתמקד ביותר ממוקד אחד בו זמנית. לא נצפו הבדלים משמעותיים ביעילות עם עד שלושה מוקדים בו זמנית. בינתיים, להכין את התאים להתחשמלות. שמור על התאים ב- RT בכל עת כדי למנוע זעזועי טמפרטורה. קצרו את התאים לאחר 48 שעות ± שעתיים של תרבית לכלי מתאים. שטפו את הכלים עם DPBS כדי לאסוף את מספר התאים המרבי. צנטריפוגה את התאים ב 200 x g במשך 10 דקות ב RT. להשליך את supernatant, ולהשהות מחדש את התאים DPBS ב ~ 2 x 106 תאים / מ”ל. שלב 10 μL של תמיסת 0.4% כחול טריפאן עם 10 μL של תרחיף התא, וספירת באמצעות המוציטומטר.הערה: בשלב זה, עקב אובדן במהלך הקציר והשטיפה, צפו לכ-60% מהתאים שהוכנסו לתרבית 48 שעות ± שעתיים קודם לכן. בינתיים, צנטריפוגו את התאים ב 200 x גרם במשך 10 דקות ב RT. השליכו את הסופרנטנט, והקפידו למזער את כל ה- DPBS שנותרו. השהה מחדש את התאים במאגר T שחומם מראש (RT) בגודל 5.55 x 107 תאים/מ”ל בהתבסס על ספירת התאים לעיל. הגדר את מערכת הטרנספקציה על-ידי הפעלת המכונה והגדרתה ל- 1,350 וולט, 15 אלפיות השנייה ופעימה אחת. מניחים את תחנת הפיפט בתוך מכסה המנוע של הזרימה הלמינרית עבור כל קבוצה של 10 אלקטרופורציות, להכין צינור transfection עם 3 מ”ל של חיץ E (עבור 10 μL transfections) או E2 (עבור 100 μL transfections). הכנס את הצינור לתחנת פיפטה. לכל אלקטרופורציה של 10 μL, שלב 1.15 μL של RNP עם 9 μL של תאים. ודא שיש נפח מספיק (+ 30%) כדי למנוע שאיפת אוויר לתוך קצה האלקטרופורציה. יש לדגור ב-RT למשך 1-2 דקות לפני ההתחשמלות. יש לשאוף 10 μL או 100 μL של RNP ותערובת תאים לתוך קצה אלקטרופורציה בגודל המתאים על פיפטת אלקטרופורציה, להכניס את פיפטה טעונה לתחנת פיפטה, ולהתחיל את electroporation. ודאו שהקצוות נקיים לחלוטין מבועות אוויר כדי למנוע קשתות. צפה במהלך אלקטרופורציה כדי לוודא שקשת אינה מתרחשת. להוציא מיד את התאים electroporated לתוך מוכן, מראש מחומם מראש, נפח קטן של בינוני עם או בלי rAAV6 בתוך 48-well (10 μL transfections) או צלחת 6-well (100 μL transfections). חזור על שלבים 5.15-5.17 עם שאר הדגימות. הוסף דגימות בקרה ללא העברה לבארות התרבית. לדגור על התאים ב 37 ° C עם 5% CO 2 במשך 4 שעות ±2 שעות, ולאחר מכן להוסיף את המדיום מוכן מראש תרבית תאי B מחומם מראש המכיל ממריצים, DMSO, אנטיביוטיקה / antimycotic: 450 μL עבור 10 μL transfections או 4.5 מ”ל עבור 100 μL transfections. המשך את הדגירה ב 37 ° C עם 5% CO2 במשך 12-24 שעות. לאחר מכן, יש לשנות את מדיום תרבית התאים מדיום ל-B המכיל ממריצים ואנטיביוטיקה/אנטי-מיקוטית ללא DMSO אם יש צורך בתרבית מורחבת. ניתוח של ה- DNA הגנומי יכול להיעשות לאחר 24 שעות. ניתן להשתמש ב-Digital droplet PCR באמצעות פריימר מחוץ לזרוע ההומולוגיה ובפריימר בתוך העלון כדי לכמת את יעילות העריכה39. ביצוע PCR כדי להגביר את אתר ההכנסה ורצף Sanger כדי לוודא עריכה נכונה. לצורך ניתוח רמות החלבון, תרבית את התאים במשך 40-48 שעות לאחר אלקטרופורציה כדי לאפשר שינויים בביטוי החלבון, ובצע ניתוח על ידי ציטומטריית זרימה באמצעות ריאגנטים בטבלה 7.