Summary

Mouse In Vivo Placental 표적 CRISPR 조작

Published: April 14, 2023
doi:

Summary

여기에서는 생체 내에서 마우스 태반의 중요한 발달 경로를 효과적으로 조작하는 시간별 방법을 설명합니다. 이것은 배아 12.5일째에 임신한 댐의 태반에 CRISPR 플라스미드를 주입하고 전기천공하여 수행됩니다.

Abstract

태반은 자궁 내 포유류의 발달을 조절하고 유지하는 필수 기관입니다. 태반은 산모와 태아 사이의 영양분과 노폐물의 전달, 성장 인자와 호르몬의 생산 및 전달을 담당합니다. 생쥐의 태반 유전자 조작은 태아 발달에서 태반의 특정 역할을 이해하는 데 중요합니다. 태반 특이적 Cre 발현 형질전환 마우스는 다양한 효과를 가지며 태반 유전자 조작을 위한 다른 방법이 유용한 대안이 될 수 있습니다. 이 논문은 표적 유전자의 발현을 수정하는 데 사용할 수 있는 CRISPR 유전자 조작을 사용하여 태반 유전자 발현을 직접 변경하는 기술을 설명합니다. 비교적 진보된 외과적 접근법을 사용하여 임신한 댐은 배아 12.5일(E12.5)에 개복술을 받고 CRISPR 플라스미드는 유리 마이크로피펫을 통해 개별 태반으로 전달됩니다. 플라스미드는 각 주입 후 즉시 전기천공됩니다. 댐 복구 후 태반과 배아는 나중에 평가될 때까지 계속 발달할 수 있습니다. 이 기술을 사용한 후 태반과 자손을 평가하면 발달에서 시간별 태반 기능의 역할을 결정할 수 있습니다. 이러한 유형의 조작을 통해 태반 유전학 및 기능이 여러 질병 상황에서 태아의 성장과 발달에 어떤 영향을 미치는지 더 잘 이해할 수 있습니다.

Introduction

태반은 태아 발달에 관여하는 필수 기관입니다. 태반의 주요 역할은 필수 요소를 제공하고 태아와의 영양분과 노폐물의 이동을 조절하는 것입니다. 포유류의 태반은 태아와 모체의 조직으로 구성되어 있으며, 태아와 모체의 경계면을 이루고 있으며, 따라서 산모와 태아의 유전적 영향이 기능에 영향을 미친다1. 태반의 유전적 기형이나 기능 장애는 태아 발달을 크게 변화시킬 수 있습니다. 이전 연구에서는 태반 유전학 및 발달이 태아의 특정 장기 시스템의 변화된 발달과 관련이 있음을 보여주었습니다. 특히, 태반의 이상은 태아의 뇌, 심장 및 혈관계의 변화와 관련이 있다 2,3,4,5.

호르몬, 성장 인자 및 기타 분자를 태반에서 태아로 운반하는 것은 태아 발달에 중요한 역할을 한다6. 특정 분자의 태반 생산을 변경하면 신경 발달이 바뀔 수 있음이 밝혀졌습니다. 산모의 염증은 태반에서 트립토판(TRP) 대사 유전자 발현을 변화시켜 세로토닌 생성을 증가시킬 수 있으며, 이는 이후 태아의 뇌에 세로토닌 축적을 생성한다7. 다른 연구에서는 심장 결함과 함께 태반 이상을 발견했습니다. 태반의 이상은 인간에게 가장 흔한 선천적 기형인 선천성 심장 기형의 원인이 되는 것으로 생각된다8. 최근 연구에 따르면 태반과 심장 모두에서 유사한 세포 경로를 가진 여러 유전자가 확인되었습니다. 이러한 경로가 중단되면 두 기관 모두에 결함이 발생할 수 있습니다9. 태반의 결함은 선천성 심장 결함을 악화시킬 수 있습니다. 특정 태아 장기 시스템 발달에 대한 태반 유전학 및 기능의 역할은 새로운 연구 분야입니다.

생쥐는 혈맥막 태반과 인간 태반의 다른 특징을 가지고 있어 인간 질병 연구에 매우 유용한 모델이 된다1. 태반의 중요성에도 불구하고, 현재 표적 생체 내 유전자 조작이 부족합니다. 또한, 현재 태반의 과발현 또는 기능 획득 조작보다 녹아웃 또는 녹다운에 사용할 수 있는 옵션이 더 많다(10). 태반 특이적 조작을 위한 여러 형질전환 Cre 발현 라인이 있으며, 각각은 서로 다른 시점에서 서로 다른 영양막 계통에 있습니다. 여기에는 Cyp19-Cre, Ada/Tpbpa-Cre, PDGFRα-CreERGcm1-Cre11,12,13,14가 포함됩니다. 이러한 Cre 이식유전자는 효율적이지만 특정 시점에서 일부 유전자를 조작할 수 없을 수 있습니다. 태반 유전자 발현을 녹아웃하거나 과발현하기 위해 일반적으로 사용되는 또 다른 방법은 렌티바이러스 벡터를 배반포 배양에 삽입하는 것인데, 이는 영양모세포 특이적 유전자 조작을 유발합니다15,16. 이 기술은 발달 초기에 태반 유전자 발현의 강력한 변화를 허용합니다. 생체 내에서 RNA 간섭의 사용은 태반에서 드물게 활용되었습니다. shRNA 플라스미드의 삽입은 본 논문에 기술된 CRIPSR 기법과 유사하게 수행될 수 있다. 이것은 태반에서 PlGF 발현을 성공적으로 감소시키기 위해 E13.5에서 수행되었으며, 자손의 뇌 혈관 구조에 영향을 미쳤다17.

녹아웃 또는 녹다운에 주로 사용되는 기술 외에도 과발현 유도는 일반적으로 아데노바이러스 또는 외인성 단백질의 삽입으로 수행됩니다. 과발현에 사용되는 기술은 다양한 성공률을 가지며 대부분 임신 후반에 수행되었습니다. 태반 기능에서 인슐린 유사 성장 인자 1(IGF-1)의 역할을 조사하기 위해 IGF-1 유전자18,19의 과발현을 유도하기 위해 선소 매개 태반 유전자 전달을 수행했습니다. 이것은 직접 태반 주사를 통해 E18.5에서 마우스 임신 후기에 수행되었습니다. 추가 옵션을 제공하고 Cre-Lox 조합 실패, 아데노바이러스의 가능한 독성 및 shRNA의 비표적 효과와 같은 확립된 태반 유전자 조작의 가능한 실패를 피하기 위해 태반의 생체 내 직접 CRISPR 조작을 사용할 수 있습니다20,21,22. 이 모델은 과발현 모델의 부족을 해결하고 유연성이 있는 모델을 만들기 위해 개발되었습니다.

이 기술은 PlGF 발현을 변경하기 위해 shRNA와 CRISPR 플라스미드를 생체 내에서 마우스 태반에 직접 표적으로 삼은 Lecuyer et al.의 연구를 기반으로 합니다17. 이 기술은 여러 시점에서 CRISPR 조작을 사용하여 태반 유전자 발현을 직접 변경하는 데 사용할 수 있습니다. 이 작업을 위해 E12.5가 선택되었습니다. 태반은 이 시점까지 성숙했고 조작할 수 있을 만큼 충분히 커서 E12.5에 특정 CRISPR 플라스미드를 삽입할 수 있으며, 이는 임신 중기에서 후기까지 태아 발달에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다23,24. 형질전환 접근법과 달리 바이러스 유도 또는 RNA 간섭과 유사한 이 기술은 비교적 진보된 외과적 접근법을 사용하여 특정 시점에서 과발현 또는 녹아웃을 허용하므로 이전 변화로 인한 태반 손상 또는 배아 치사 가능성을 방지합니다. 소수의 태반만이 한 배설물 내에서 실험 또는 대조 플라스미드를 받기 때문에 이 접근 방식은 두 가지 유형의 내부 제어를 허용합니다. 이러한 대조군은 적절한 대조군 플라스미드로 주입 및 전기천공된 대조군과 직접적인 조작을 받지 않는 대조군입니다. 이 기술은 상승 활성화 매개체(SAM) CRISPR 플라스미드를 통해 마우스 태반에서 IGF-1 유전자의 과발현을 생성하도록 최적화되었습니다. IGF-1 유전자는 출생 전에 태반에서 주로 생산되는 태아에게 전달되는 필수 성장 호르몬이기 때문에선택되었습니다 25,26. 이 새로운 태반 표적 CRISPR 기술은 태반 기능과 태아 발달 사이의 연관성을 정의하는 데 도움이 되는 직접 조작을 가능하게 합니다.

Protocol

모든 절차는 연방 규정 및 아이오와 대학 정책에 따라 수행되었으며 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다. 1. 동물과 축산 동물에게 음식과 물을 임의로 12시간 일광 주기로 유지하십시오. 생후 8-15주령의 CD-1 암컷 마우스를 사용한다. E0.5를 식별하기 위해 교합 플러그가 있는지 확인하십시오. E0.5에서 임신한 댐을 단독?…

Representative Results

일반 절차 결과(그림 6)이 연구에는 세 가지 조작 된 그룹이있었습니다. 여기에는 일반적인 CRISPR Cas9 대조군 플라스미드(Cas9 Control), 활성화 대조군 CRISPR 플라스미드(Act Control) 또는 IGF-1 SAM 활성화 플라스미드(Igf1-OE)가 주입된 태반이 포함되었습니다. Cas9 Control은 knockout 플라스미드에 더 적합하며, activation control은 과발현/활성화 플라스미드?…

Discussion

태반은 태아 성장의 일차적 조절인자이며, 앞서 언급했듯이 태반 유전자 발현 또는 기능의 변화는 태아 발달에 상당한 영향을 미칠 수 있다6. 여기에 설명된 프로토콜은 비교적 진보된 외과적 접근법을 사용하여 마우스 태반의 표적 생체 내 CRISPR 조작을 수행하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술은 추가 연구에 사용할 수 있는 생존 가능한 배아와 해당 태반의 상당한 수확?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자는 R01 MH122435, NIH T32GM008629 및 NIH T32GM145441과 같은 자금 출처를 인정합니다. 저자는 수술실과 장비를 사용한 아이오와 대학의 Val Sheffield 박사와 Calvin Carter 박사의 연구실, 현미경 검사에 도움을 준 Eric Van Otterloo 박사, Nandakumar Narayanan 박사, Matthew Weber 박사에게 감사를 표합니다. 저자는 또한 파일럿 수술에 도움을 준 Sara Maurer 박사, Maya Evans 및 Sreelekha Kundu에게 감사를 표합니다.

Materials

1.5 ml Tubes USA Scientific Inc 1615-5500
4% Paraformeldhyde (PFA) in PBS Thermo Fisher Scientific J61899.AP
96 Well plate Cornings 3598 For BCA kit
Absorbent Underpads Fisher Scientific 14-206-62
Activation Control Plasmid Santa Cruz Biotechnology sc-437275 Dnase-free water provided for dilution
AMV Reverse Transcriptase New England Biolabs M0277L Use for cDNA synthesis
Anesthetic Gas Vaporizor Vetamac VAD-601TT VAD-compact vaporizer
Artifical Tear Gel Akorn NDC 59399-162-35
BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific 23227 Protein quantification
Biovortexer Bellco Glass, Inc. 198050000 Hand-held tissue homogenizer
CellSens Software Olympus V4.1.1 Image processing to FISH images.
Centrifuge 5810 Eppendorf EP022628168 Plate centrifuge
Chloroform Thermo Fisher Scientific J67241-AP RNA isolation
Cotton Tipped Applicators ProAdvantage 77100 Sterilize before use
CRISPR/Cas9 Control Plasmid Santa Cruz Biotechnology sc-418922 Dnase-free water provided for dilution
CryoStat Leica CM1950
Dissection Microscope Leica M125 C Used for post-necroscopy imaging
Dissolvable Sutures Med Vet International J385H
Distilled Water Gibco 15230162
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) Thermo fisher Scientific 14190144 (-) Calcium; (-) Magnesium
ECM 830 Electro Electroporator (Electroporation Machine) BTX Harvard Apparatus 45-0662 Generator only
Electric Razor Wahl CL9990 Kent Scientific
Electroporation paddles/Tweezertrodes BTX Harvard Apparatus 45-0487 3 mm diameter paddles; wires included
Embedding Cassette: 250 PK Grainger 21RK94 Placenta embedding cassettes
Ethanol Thermo Fisher Scientific 268280010
F-Air Canisters Penn Veterinary Supply Inc BIC80120 Excess isoflurane filter
Fast Green Dye FCF Sigma F7252-5G Dissolve to 1 μg/ml and filter; protect from light
Filter-based microplate photometer (plate reader) Fisher Scientific 14377576 Can be used for BCA and ELISA
Forceps VWR 82027-386 Fine tips, straight, serrated
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma Aldrich HT501128
Glass Capillaries – Borosilicate Glass (Micropipette) Sutter Instrument B150-86-10 O.D.: 1.5 mm, I.D.: 0.86 mm, 10 cm length
Halt Protease and Phosphotase inhibitor cocktail (100x) Thermo Scientific 1861281 Protein homogenization buffer
Heating Pad Thermotech S766D Digitial Moist Heating Pad
Hemostats VWR 10806-188 Fully surrated jaw; curved
Hot Water Bath Fisher Scientific 20253 Isotemp 205
Igf-1 SAM Plasmid (m1) Santa Cruz Biotechnology sc-421056-ACT Dnase-free water provided for dilution
Induction Chamber Vetamac 941443 No specific liter size required
Isoflurane Piramal Pharma Limited NDC 66794-013-25
Isoproponal/2-Proponal Fisher Scientific A451-4 RNA isolation
Ketamine HCl 100mg/ml Akorn NDC 59399-114-10
MgCl2/Magneisum Chloride Sigma Aldrich 63069-100ML 1M. Protein homogenization buffer
MicroAmp™ Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode Fisher Scientific 4309849 Barcoded plates not required
Microcapillary Tip Eppendorf 5196082001 Attached to BTX Microinjector
Microinjector BTX Harvard Apparatus 45-0766 Stainless Steel Pipette Holder, 130 mm Length, for 1 to 1.5 mm Pipettes
Microject 1000A (Injection Machine) BTX Harvard Apparatus 45-0751 MicroJect 1000A Plus System
Micropipette Puller Model P-97 Sutter Instrument P-97 Flaming/Brown type micropipette puller
Microplate Mixer (Plate Shaker) scilogex 822000049999
Mouse/Rat IGF-I/IGF-1 Quantikine ELISA Kit R & D Systems MG100
Needles BD – Becton, Dickson, and Company 305106 30 Gx 1/2 (0.3 mm x 13 mm)
Nitrogen Tank Linde 7727-37-9 Any innert gas
Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drug (NSAID) Norbrook Laboratories Limited NDC 55529-040-10 Analesgic such as Meloxicam
Nose Cone Vetamac 921609 9-14 mm
Opal 620 detection dye Akoya Biosciences SKU FP1495001KT Used for FISH
Optimal Cutting Temperature (O.C.T) Compound Sakura 4583
Oxygen Tank Linde 7782 – 44 – 7 Medical grade oxygen
Pestles USA Scientific Inc 14155390
Povidone-Iodine Solution, 5% Avrio Health L.P. NDC 67618-155-16
Power SYBR™ Green PCR Master Mix Thermo Fisher Scientific 4367659 Use for qPCR
Random Hexamers (Random Primers) New England Biolabs S1330S Use for cDNA synthesis
Razor Blade Grainger 26X080
RNA Cleanup Kit & Concentrator Zymo Research R1013
RNALater Thermo Fisher Scientific AM7021
RNAscope kit v.2.5 Advanced Cells Diagnostics 323100 Contains all reagents required for fluorescent in situ hybridization. Probes sold separately.
RNAscope™ Probe- Mm-Prl8a8-C2 Advanced Cells Diagnostics  528641-C2
RNAscope™ Probe- Vector-dCas9-3xNLS-VP64 Advanced Cells Diagnostics 527421
Roto-Therm Mini Benchmark R2020 Dry oven for in situ hybridization
Scissors VWR 82027-578 Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4¹/₂
Sodium Chloride (Saline) Hospra NDC 0409-4888-03 Sterile,  0.9%
Sodium Citrate, Trisodium Salt, Dihydrate, [Citric Acid, Trisodium Dihydrate] Research Product International 03-04-6132
Sodium Hydroxide 1N Concentrate, Fisher Chemical Fisher Scientific SS277 Protein homogenization buffer
Steamer Bella B00DPX8UBA
Sterile Surgical Drape Busse 696 Sterilize before use
Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Surgipath Cover Glass 24×60 Leica 3800160
Syringes BD – Becton, Dickson, and Company 309659 BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single use, 1 mL
Thermo Scientific™ Invitrogen™ Nanodrop™ One Spectrophotometer with WiFi and Qubit™ 4 Fluorometer Fisher Scientific 13-400-525 This configuration comes with Qubit 4 fluorometer.  Qubit quantification not required.
Tissue Adhesive 3M 1469SB VetBond
Tris HCl Thermo Fisher Scientific 15568025 1M. Protein homogenization buffer
TRIzol™ Reagent Thermo Fisher Scientific 15596018 RNA isolation
TSA Buffer Pack Advanced Cells Diagnostics 322810 Used to dilute Opal 620 detection dye
Universal F-Circuit Vetamac 40200 Attached to vaporizer and vaporizer accessories
Upright Compound Fluorescence Microscope Olympus BX61VS Used for FISH imaging
Vectorshield with DAPI Vector Laboratories H-1200 Coverslip mounting media
ViiA™ 7 Real-Time PCR System with 384-Well Block Thermo Fisher Scientific 4453536 This is for SYBR 384-well block detection.  TaqMan and/or smaller blocks available
Wet n Wild Nail Polish Wild Shine, Clear Nail Protector, Nail Color Amazon C450B
Xylazine 20mg/ml Anased 343730_RX

References

  1. Cross, J. C., et al. Genes, development and evolution of the placenta. Placenta. 24 (2-3), 123-130 (2003).
  2. Perez-Garcia, V., et al. Placentation defects are highly prevalent in embryonic lethal mouse mutants. Nature. 555 (7697), 463-468 (2018).
  3. Rosenfeld, C. S. The placenta-brain-axis. Journal of Neuroscience Research. 99 (1), 271-283 (2021).
  4. Maslen, C. L. Recent advances in placenta-heart interactions. Frontiers in Physiology. 9, 735 (2018).
  5. Kundu, S., Maurer, S. V., Stevens, H. E. Future horizons for neurodevelopmental disorders: Placental mechanisms. Frontiers in Pediatrics. 9, 653230 (2021).
  6. Woods, L., Perez-Garcia, V., Hemberger, M. Regulation of placental development and its impact on fetal growth-new insights from mouse models. Frontiers in Endocrinology. 9, 570 (2018).
  7. Goeden, N., et al. Maternal Inflammation disrupts fetal neurodevelopment via increased placental output of serotonin to the fetal brain. Journal of Neuroscience. 36 (22), 6041-6049 (2016).
  8. vander Bom, T., et al. The changing epidemiology of congenital heart disease. Nature Reviews Cardiology. 8 (1), 50-60 (2011).
  9. Wilson, R. L., et al. Analysis of commonly expressed genes between first trimester fetal heart and placenta cell types in the context of congenital heart disease. Scientific Reports. 12 (1), 10756 (2022).
  10. Renaud, S. J., Karim Rumi, M. A., Soares, M. J. Review: Genetic manipulation of the rodent placenta. Placenta. 32, S130-S135 (2011).
  11. Wenzel, P. L., Leone, G. Expression of Cre recombinase in early diploid trophoblast cells of the mouse placenta. Genesis. 45 (3), 129-134 (2007).
  12. Zhou, C. C., et al. Targeted expression of Cre recombinase provokes placental-specific DNA recombination in transgenic mice. PLoS One. 7 (2), e29236 (2012).
  13. Wattez, J. S., Qiao, L., Lee, S., Natale, D. R. C., Shao, J. The platelet-derived growth factor receptor alpha promoter-directed expression of cre recombinase in mouse placenta. Developmental Dynamics. 248 (5), 363-374 (2019).
  14. Nadeau, V., et al. Map2k1 and Map2k2 genes contribute to the normal development of syncytiotrophoblasts during placentation. Development. 136 (8), 1363-1374 (2009).
  15. Chakraborty, D., Muto, M., Soares, M. J. Ex vivo trophoblast-specific genetic manipulation using lentiviral delivery. BioProtocol. 7 (24), e2652 (2017).
  16. Okada, Y., et al. Complementation of placental defects and embryonic lethality by trophoblast-specific lentiviral gene transfer. Nature Biotechnology. 25 (2), 233-237 (2007).
  17. Lecuyer, M., et al. a placental marker of fetal brain defects after in utero alcohol exposure. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 44 (2017).
  18. Jones, H. N., Crombleholme, T., Habli, M. Adenoviral-mediated placental gene transfer of IGF-1 corrects placental insufficiency via enhanced placental glucose transport mechanisms. PLoS One. 8 (9), e74632 (2013).
  19. Jones, H., Crombleholme, T., Habli, M. Regulation of amino acid transporters by adenoviral-mediated human insulin-like growth factor-1 in a mouse model of placental insufficiency in vivo and the human trophoblast line BeWo in vitro. Placenta. 35 (2), 132-138 (2014).
  20. Song, A. J., Palmiter, R. D. Detecting and avoiding problems when using the Cre-lox system. Trends in Genetics. 34 (5), 333-340 (2018).
  21. Chuah, M. K., Collen, D., VandenDriessche, T. Biosafety of adenoviral vectors. Current Gene Therapy. 3 (6), 527-543 (2003).
  22. Evers, B., et al. CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).
  23. Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: Lessons from mouse mutants. Nature Reviews Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).
  24. Elmore, S. A., et al. Histology atlas of the developing mouse placenta. Toxicologic Pathology. 50 (1), 60-117 (2022).
  25. Sferruzzi-Perri, A. N., Sandovici, I., Constancia, M., Fowden, A. L. Placental phenotype and the insulin-like growth factors: Resource allocation to fetal growth. The Journal of Physiology. 595 (15), 5057-5093 (2017).
  26. Agrogiannis, G. D., Sifakis, S., Patsouris, E. S., Konstantinidou, A. E. Insulin-like growth factors in embryonic and fetal growth and skeletal development (Review). Molecular Medicine Reports. 10 (2), 579-584 (2014).
  27. Wang, L., Jiang, H., Brigande, J. V. Gene transfer to the developing mouse inner ear by in vivo electroporation. Journal of Visualized Experiments. (64), e3653 (2012).
  28. Elser, B. A., et al. Combined maternal exposure to cypermethrin and stress affect embryonic brain and placental outcomes in mice. Toxicological Sciences. 175 (2), 182-196 (2020).
  29. Gumusoglu, S. B., et al. Chronic maternal interleukin-17 and autism-related cortical gene expression, neurobiology, and behavior. Neuropsychopharmacology. 45 (6), 1008-1017 (2020).
  30. Liu, F., Huang, L. Electric gene transfer to the liver following systemic administration of plasmid DNA. Gene Therapy. 9 (16), 1116-1119 (2002).
  31. Kalli, C., Teoh, W. C., Leen, E. Introduction of genes via sonoporation and electroporation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 818, 231-254 (2014).
  32. Wu, W., et al. Efficient in vivo gene editing using ribonucleoproteins in skin stem cells of recessive dystrophic epidermolysis bullosa mouse model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (7), 1660-1665 (2017).
  33. Nakamura, H. . Electroporation and Sonoporation in Developmental Biology. , (2009).
  34. Bond, A. M., et al. Differential timing and coordination of neurogenesis and astrogenesis in developing mouse hippocampal subregions. Brain Sciences. 10 (12), 909 (2020).
  35. Kojima, Y., Tam, O. H., Tam, P. P. Timing of developmental events in the early mouse embryo. Seminars in Cell & Developmental Biology. 34, 65-75 (2014).
  36. Pennington, K. A., Schlitt, J. M., Schulz, L. C. Isolation of primary mouse trophoblast cells and trophoblast invasion assay. Journal of Visualized Experiments. (59), e3202 (2012).
  37. Mandegar, M. A., et al. CRISPR Interference efficiently induces specific and reversible gene silencing in human iPSCs. Cell Stem Cell. 18 (4), 541-553 (2016).
  38. Dai, Z., et al. Inducible CRISPRa screen identifies putative enhancers. Journal of Genetics and Genomics. 48 (10), 917-927 (2021).
  39. Ursini, G., et al. Placental genomic risk scores and early neurodevelopmental outcomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. (7), e2019789118 (2021).
  40. Smajdor, A. Ethical challenges in fetal surgery. Journal of Medical Ethics. 37 (2), 88-91 (2011).
  41. Antiel, R. M. Ethical challenges in the new world of maternal-fetal surgery. Seminars in Perinatology. 40 (4), 227-233 (2016).

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Citer Cet Article
Carver, A. J., Taylor, R. J., Stevens, H. E. Mouse In Vivo Placental Targeted CRISPR Manipulation. J. Vis. Exp. (194), e64760, doi:10.3791/64760 (2023).

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