Summary

الماوس في الجسم الحي المشيمة المستهدفة كريسبر التلاعب

Published: April 14, 2023
doi:

Summary

نصف هنا طريقة محددة زمنيا للتعامل بفعالية مع المسارات التنموية الحرجة في مشيمة الفأر في الجسم الحي. يتم إجراء ذلك من خلال الحقن والتثقيب الكهربائي لبلازميدات كريسبر في مشيمة السدود الحامل في اليوم الجنيني 12.5.

Abstract

المشيمة هي عضو أساسي ينظم ويحافظ على نمو الثدييات في الرحم. المشيمة مسؤولة عن نقل العناصر الغذائية والفضلات بين الأم والجنين وإنتاج وتوصيل عوامل النمو والهرمونات. تعد التلاعب الجيني المشيمي في الفئران أمرا بالغ الأهمية لفهم الدور المحدد للمشيمة في تطور ما قبل الولادة. الفئران المعدلة وراثيا المعبرة عن المشيمة لها فعالية متفاوتة ، ويمكن أن تكون الطرق الأخرى لمعالجة الجينات المشيمة بدائل مفيدة. تصف هذه الورقة تقنية لتغيير التعبير الجيني المشيمي مباشرة باستخدام معالجة الجينات كريسبر ، والتي يمكن استخدامها لتعديل التعبير عن الجينات المستهدفة. باستخدام نهج جراحي متقدم نسبيا ، تخضع السدود الحامل لبضع البطن في اليوم الجنيني 12.5 (E12.5) ، ويتم تسليم بلازميد كريسبر بواسطة ماصة زجاجية دقيقة إلى المشيمة الفردية. يتم إلكتروبيد البلازميد على الفور بعد كل حقنة. بعد تعافي السد، يمكن أن تستمر المشيمة والأجنة في النمو حتى التقييم في وقت لاحق. يمكن أن يحدد تقييم المشيمة والنسل بعد استخدام هذه التقنية دور وظيفة المشيمة المحددة زمنيا في التنمية. سيسمح هذا النوع من التلاعب بفهم أفضل لكيفية تأثير علم الوراثة المشيمة ووظيفتها على نمو الجنين وتطوره في سياقات مرضية متعددة.

Introduction

المشيمة هي عضو أساسي يشارك في نمو الجنين. يتمثل الدور الرئيسي للمشيمة في توفير العوامل الأساسية وتنظيم نقل العناصر الغذائية والفضلات من وإلى الجنين. تتكون مشيمة الثدييات من أنسجة الجنين والأم ، والتي تشكل واجهة الجنين والأم ، وبالتالي ، فإن الوراثة لكل من الأم والجنين تؤثر على الوظيفة1. يمكن أن تؤدي التشوهات الوراثية أو ضعف وظيفة المشيمة إلى تغيير نمو الجنين بشكل كبير. أظهرت الأعمال السابقة أن علم الوراثة المشيمية وتطورها يرتبطان بالتطور المتغير لأنظمة أعضاء معينة في الجنين. على وجه الخصوص ، ترتبط التشوهات في المشيمة بالتغيرات في دماغ الجنين والقلب ونظام الأوعية الدموية2،3،4،5.

يلعب نقل الهرمونات وعوامل النمو والجزيئات الأخرى من المشيمة إلى الجنين دورا رئيسيا في نمو الجنين6. لقد ثبت أن تغيير إنتاج المشيمة لجزيئات معينة يمكن أن يغير النمو العصبي. يمكن أن يزيد التهاب الأم من إنتاج السيروتونين عن طريق تغيير التعبير الجيني الأيضي للتريبتوفان (TRP) في المشيمة ، مما يؤدي لاحقا إلى تراكم السيروتونين في دماغ الجنين7. وقد وجدت دراسات أخرى تشوهات المشيمة جنبا إلى جنب مع عيوب القلب. يعتقد أن التشوهات في المشيمة تساهم في عيوب القلب الخلقية ، وهو أكثر العيوب الخلقية شيوعا لدى البشر8. حددت دراسة حديثة العديد من الجينات التي لها مسارات خلوية مماثلة في كل من المشيمة والقلب. إذا تعطلت ، يمكن أن تسبب هذه المسارات عيوبا في كلا الجهازين9. قد تؤدي العيوب في المشيمة إلى تفاقم عيوب القلب الخلقية. يعد دور علم الوراثة المشيمة ووظيفتها في تطوير نظام أعضاء الجنين المحدد مجالا ناشئا للدراسة.

الفئران لديها المشيمة الدموية وغيرها من ميزات المشيمة البشرية ، مما يجعلها نماذج مفيدة للغاية لدراسة الأمراض البشرية1. على الرغم من أهمية المشيمة ، يوجد حاليا نقص في التلاعب الجيني المستهدف في الجسم الحي. علاوة على ذلك ، يوجد حاليا المزيد من الخيارات المتاحة للضربة القاضية أو الضربات القاضية أكثر من الإفراط في التعبير أو التلاعب باكتساب الوظيفة في المشيمة10. هناك العديد من خطوط التعبير عن الكري المعدلة وراثيا للتلاعب الخاص بالمشيمة ، كل منها في سلالات الأرومة الغاذية المختلفة في نقاط زمنية مختلفة. وتشمل هذه Cyp19-Cre و Ada / Tpbpa-Cre و PDGFRα-CreER و Gcm1-Cre 11،12،13،14. في حين أن جينات التحوير Cre هذه فعالة ، فقد لا تكون قادرة على التلاعب ببعض الجينات في نقاط زمنية محددة. هناك طريقة أخرى شائعة الاستخدام إما للتعبير الجيني عن الضربة القاضية أو الإفراط في التعبير عن التعبير الوراثي المشيمي وهي إدخال ناقلات الفيروسات العدسية في مزرعة الكيسة الأريمية ، مما يؤدي إلى التلاعب الجيني الخاص بالأرومة الغاذية15,16. تسمح هذه التقنية بتغيير قوي في التعبير الجيني المشيمي في وقت مبكر من التطور. تم استخدام تداخل الحمض النووي الريبي في الجسم الحي بشكل ضئيل في المشيمة. يمكن إجراء إدخال بلازميدات shRNA بشكل مشابه لتقنية CRIPSR الموضحة في هذه الورقة. وقد تم ذلك في E13.5 لتقليل تعبير PlGF بنجاح في المشيمة ، مع تأثيرات على الأوعية الدموية في الدماغالنسل 17.

بالإضافة إلى التقنيات التي تستخدم في المقام الأول للضربة القاضية أو الضربة القاضية ، يتم إجراء الإفراط في التعبير بشكل شائع مع الفيروسات الغدية أو إدخال بروتين خارجي. التقنيات المستخدمة للإفراط في التعبير لها معدلات نجاح متفاوتة وقد تم إجراؤها في الغالب في وقت لاحق من الحمل. للتحقيق في دور عامل النمو الشبيه بالأنسولين 1 (IGF-1) في وظيفة المشيمة ، تم إجراء نقل جين المشيمة بوساطة غدية للحث على الإفراط في التعبير عن جين IGF-1 18,19. تم إجراء ذلك في وقت متأخر من حمل الفئران على E18.5 عن طريق حقن المشيمة المباشر. لتوفير خيارات إضافية والتحايل على الإخفاقات المحتملة للتلاعبات الجينية المشيمية الراسخة ، مثل فشل تركيبة Cre-Lox ، والسمية المحتملة للفيروسات الغدية ، والآثار غير المستهدفة ل shRNA ، يمكن استخدام معالجة CRISPR المباشرة للمشيمة في الجسم الحي 20،21،22. تم تطوير هذا النموذج لمعالجة عدم وجود نماذج الإفراط في التعبير ولإنشاء نموذج يتسم بالمرونة.

تعتمد هذه التقنية على عمل Lecuyer et al. ، حيث تم استهداف بلازميدات shRNA و CRISPR مباشرة في الجسم الحي إلى مشيمة الفئران لتغيير تعبير PlGF 17. يمكن استخدام هذه التقنية لتغيير التعبير الجيني المشيمي مباشرة باستخدام معالجة كريسبر في نقاط زمنية متعددة. لهذا العمل ، تم اختيار E12.5. نضجت المشيمة عند هذه النقطة وهي كبيرة بما يكفي للتلاعب بها ، مما يسمح بإدخال بلازميد كريسبر معين على E12.5 ، والذي يمكن أن يكون له تأثير كبير على نمو الجنين من منتصف إلى أواخر الحمل23,24. على عكس الأساليب المعدلة وراثيا ، ولكن على غرار التحريضات الفيروسية أو تداخل الحمض النووي الريبي ، تسمح هذه التقنية بالإفراط في التعبير أو الضربة القاضية في نقاط زمنية معينة باستخدام نهج جراحي متقدم نسبيا ، وبالتالي تجنب ضعف المشيمة المحتمل أو الفتك الجنيني من التغييرات السابقة. نظرا لأن عددا قليلا فقط من المشيمة يتلقى البلازميد التجريبي أو الرقابي داخل القمامة ، فإن النهج يسمح بنوعين من الضوابط الداخلية. هذه الضوابط هي تلك التي يتم حقنها وتزويدها بالكهرباء باستخدام بلازميد التحكم المناسب وتلك التي لا تتلقى أي معالجة مباشرة. تم تحسين هذه التقنية لإنشاء تعبير مفرط عن جين IGF-1 في مشيمة الفأر عبر وسيط التنشيط التآزري (SAM) CRISPR Plasmid. تم اختيار جين IGF-1 ، حيث أن IGF-1 هو هرمون نمو أساسي يتم تسليمه إلى الجنين ويتم إنتاجه بشكل أساسي في المشيمة قبل الولادة25,26. ستسمح تقنية كريسبر الجديدة التي تستهدف المشيمة بالتلاعب المباشر للمساعدة في تحديد العلاقة بين وظيفة المشيمة ونمو الجنين.

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا والامتثال للوائح الفيدرالية وسياسة جامعة أيوا وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية. 1. الحيوانات والتربية حافظ على الحيوانات في دورة ضوء النهار لمدة 12 ساعة مع الطعام والماء الإعلاني. استخدم إ?…

Representative Results

نتائج الإجراءات العامة (الشكل 6)في الدراسة ، كانت هناك ثلاث مجموعات تم التلاعب بها. وشملت هذه المشيمة التي تم حقنها ببلازميد التحكم العام CRISPR Cas9 (Cas9 Control) ، أو بلازميد CRISPR للتحكم في التنشيط (التحكم في الفعل) ، أو بلازميد تنشيط IGF-1 SAM (Igf1-OE). يعتبر Cas9 Control …

Discussion

المشيمة هي المنظم الأساسي لنمو الجنين ، وكما لوحظ سابقا ، فإن التغيرات في التعبير الجيني للمشيمة أو وظيفتها قد تؤثر بشكل كبير على نمو الجنين6. يمكن استخدام البروتوكول الموضح هنا لإجراء معالجة مستهدفة في الجسم الحي بتقنية كريسبر لمشيمة الفأر باستخدام نهج جراحي متقدم نسبي…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

يقر المؤلفون بمصادر التمويل التالية: R01 MH122435 و NIH T32GM008629 و NIH T32GM145441. يشكر المؤلفون مختبرات الدكتور فال شيفيلد والدكتور كالفن كارتر في جامعة أيوا على استخدام غرفة الجراحة والمعدات الخاصة بهم ، وكذلك الدكتور إريك فان أوترلو والدكتور نانداكومار نارايانان والدكتور ماثيو ويبر لمساعدتهم في الفحص المجهري. كما يشكر المؤلفون الدكتورة سارة ماورير ومايا إيفانز وسريليخا كوندو على مساعدتهم في العمليات الجراحية التجريبية.

Materials

1.5 ml Tubes USA Scientific Inc 1615-5500
4% Paraformeldhyde (PFA) in PBS Thermo Fisher Scientific J61899.AP
96 Well plate Cornings 3598 For BCA kit
Absorbent Underpads Fisher Scientific 14-206-62
Activation Control Plasmid Santa Cruz Biotechnology sc-437275 Dnase-free water provided for dilution
AMV Reverse Transcriptase New England Biolabs M0277L Use for cDNA synthesis
Anesthetic Gas Vaporizor Vetamac VAD-601TT VAD-compact vaporizer
Artifical Tear Gel Akorn NDC 59399-162-35
BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific 23227 Protein quantification
Biovortexer Bellco Glass, Inc. 198050000 Hand-held tissue homogenizer
CellSens Software Olympus V4.1.1 Image processing to FISH images.
Centrifuge 5810 Eppendorf EP022628168 Plate centrifuge
Chloroform Thermo Fisher Scientific J67241-AP RNA isolation
Cotton Tipped Applicators ProAdvantage 77100 Sterilize before use
CRISPR/Cas9 Control Plasmid Santa Cruz Biotechnology sc-418922 Dnase-free water provided for dilution
CryoStat Leica CM1950
Dissection Microscope Leica M125 C Used for post-necroscopy imaging
Dissolvable Sutures Med Vet International J385H
Distilled Water Gibco 15230162
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) Thermo fisher Scientific 14190144 (-) Calcium; (-) Magnesium
ECM 830 Electro Electroporator (Electroporation Machine) BTX Harvard Apparatus 45-0662 Generator only
Electric Razor Wahl CL9990 Kent Scientific
Electroporation paddles/Tweezertrodes BTX Harvard Apparatus 45-0487 3 mm diameter paddles; wires included
Embedding Cassette: 250 PK Grainger 21RK94 Placenta embedding cassettes
Ethanol Thermo Fisher Scientific 268280010
F-Air Canisters Penn Veterinary Supply Inc BIC80120 Excess isoflurane filter
Fast Green Dye FCF Sigma F7252-5G Dissolve to 1 μg/ml and filter; protect from light
Filter-based microplate photometer (plate reader) Fisher Scientific 14377576 Can be used for BCA and ELISA
Forceps VWR 82027-386 Fine tips, straight, serrated
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma Aldrich HT501128
Glass Capillaries – Borosilicate Glass (Micropipette) Sutter Instrument B150-86-10 O.D.: 1.5 mm, I.D.: 0.86 mm, 10 cm length
Halt Protease and Phosphotase inhibitor cocktail (100x) Thermo Scientific 1861281 Protein homogenization buffer
Heating Pad Thermotech S766D Digitial Moist Heating Pad
Hemostats VWR 10806-188 Fully surrated jaw; curved
Hot Water Bath Fisher Scientific 20253 Isotemp 205
Igf-1 SAM Plasmid (m1) Santa Cruz Biotechnology sc-421056-ACT Dnase-free water provided for dilution
Induction Chamber Vetamac 941443 No specific liter size required
Isoflurane Piramal Pharma Limited NDC 66794-013-25
Isoproponal/2-Proponal Fisher Scientific A451-4 RNA isolation
Ketamine HCl 100mg/ml Akorn NDC 59399-114-10
MgCl2/Magneisum Chloride Sigma Aldrich 63069-100ML 1M. Protein homogenization buffer
MicroAmp™ Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode Fisher Scientific 4309849 Barcoded plates not required
Microcapillary Tip Eppendorf 5196082001 Attached to BTX Microinjector
Microinjector BTX Harvard Apparatus 45-0766 Stainless Steel Pipette Holder, 130 mm Length, for 1 to 1.5 mm Pipettes
Microject 1000A (Injection Machine) BTX Harvard Apparatus 45-0751 MicroJect 1000A Plus System
Micropipette Puller Model P-97 Sutter Instrument P-97 Flaming/Brown type micropipette puller
Microplate Mixer (Plate Shaker) scilogex 822000049999
Mouse/Rat IGF-I/IGF-1 Quantikine ELISA Kit R & D Systems MG100
Needles BD – Becton, Dickson, and Company 305106 30 Gx 1/2 (0.3 mm x 13 mm)
Nitrogen Tank Linde 7727-37-9 Any innert gas
Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drug (NSAID) Norbrook Laboratories Limited NDC 55529-040-10 Analesgic such as Meloxicam
Nose Cone Vetamac 921609 9-14 mm
Opal 620 detection dye Akoya Biosciences SKU FP1495001KT Used for FISH
Optimal Cutting Temperature (O.C.T) Compound Sakura 4583
Oxygen Tank Linde 7782 – 44 – 7 Medical grade oxygen
Pestles USA Scientific Inc 14155390
Povidone-Iodine Solution, 5% Avrio Health L.P. NDC 67618-155-16
Power SYBR™ Green PCR Master Mix Thermo Fisher Scientific 4367659 Use for qPCR
Random Hexamers (Random Primers) New England Biolabs S1330S Use for cDNA synthesis
Razor Blade Grainger 26X080
RNA Cleanup Kit & Concentrator Zymo Research R1013
RNALater Thermo Fisher Scientific AM7021
RNAscope kit v.2.5 Advanced Cells Diagnostics 323100 Contains all reagents required for fluorescent in situ hybridization. Probes sold separately.
RNAscope™ Probe- Mm-Prl8a8-C2 Advanced Cells Diagnostics  528641-C2
RNAscope™ Probe- Vector-dCas9-3xNLS-VP64 Advanced Cells Diagnostics 527421
Roto-Therm Mini Benchmark R2020 Dry oven for in situ hybridization
Scissors VWR 82027-578 Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4¹/₂
Sodium Chloride (Saline) Hospra NDC 0409-4888-03 Sterile,  0.9%
Sodium Citrate, Trisodium Salt, Dihydrate, [Citric Acid, Trisodium Dihydrate] Research Product International 03-04-6132
Sodium Hydroxide 1N Concentrate, Fisher Chemical Fisher Scientific SS277 Protein homogenization buffer
Steamer Bella B00DPX8UBA
Sterile Surgical Drape Busse 696 Sterilize before use
Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Surgipath Cover Glass 24×60 Leica 3800160
Syringes BD – Becton, Dickson, and Company 309659 BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single use, 1 mL
Thermo Scientific™ Invitrogen™ Nanodrop™ One Spectrophotometer with WiFi and Qubit™ 4 Fluorometer Fisher Scientific 13-400-525 This configuration comes with Qubit 4 fluorometer.  Qubit quantification not required.
Tissue Adhesive 3M 1469SB VetBond
Tris HCl Thermo Fisher Scientific 15568025 1M. Protein homogenization buffer
TRIzol™ Reagent Thermo Fisher Scientific 15596018 RNA isolation
TSA Buffer Pack Advanced Cells Diagnostics 322810 Used to dilute Opal 620 detection dye
Universal F-Circuit Vetamac 40200 Attached to vaporizer and vaporizer accessories
Upright Compound Fluorescence Microscope Olympus BX61VS Used for FISH imaging
Vectorshield with DAPI Vector Laboratories H-1200 Coverslip mounting media
ViiA™ 7 Real-Time PCR System with 384-Well Block Thermo Fisher Scientific 4453536 This is for SYBR 384-well block detection.  TaqMan and/or smaller blocks available
Wet n Wild Nail Polish Wild Shine, Clear Nail Protector, Nail Color Amazon C450B
Xylazine 20mg/ml Anased 343730_RX

References

  1. Cross, J. C., et al. Genes, development and evolution of the placenta. Placenta. 24 (2-3), 123-130 (2003).
  2. Perez-Garcia, V., et al. Placentation defects are highly prevalent in embryonic lethal mouse mutants. Nature. 555 (7697), 463-468 (2018).
  3. Rosenfeld, C. S. The placenta-brain-axis. Journal of Neuroscience Research. 99 (1), 271-283 (2021).
  4. Maslen, C. L. Recent advances in placenta-heart interactions. Frontiers in Physiology. 9, 735 (2018).
  5. Kundu, S., Maurer, S. V., Stevens, H. E. Future horizons for neurodevelopmental disorders: Placental mechanisms. Frontiers in Pediatrics. 9, 653230 (2021).
  6. Woods, L., Perez-Garcia, V., Hemberger, M. Regulation of placental development and its impact on fetal growth-new insights from mouse models. Frontiers in Endocrinology. 9, 570 (2018).
  7. Goeden, N., et al. Maternal Inflammation disrupts fetal neurodevelopment via increased placental output of serotonin to the fetal brain. Journal of Neuroscience. 36 (22), 6041-6049 (2016).
  8. vander Bom, T., et al. The changing epidemiology of congenital heart disease. Nature Reviews Cardiology. 8 (1), 50-60 (2011).
  9. Wilson, R. L., et al. Analysis of commonly expressed genes between first trimester fetal heart and placenta cell types in the context of congenital heart disease. Scientific Reports. 12 (1), 10756 (2022).
  10. Renaud, S. J., Karim Rumi, M. A., Soares, M. J. Review: Genetic manipulation of the rodent placenta. Placenta. 32, S130-S135 (2011).
  11. Wenzel, P. L., Leone, G. Expression of Cre recombinase in early diploid trophoblast cells of the mouse placenta. Genesis. 45 (3), 129-134 (2007).
  12. Zhou, C. C., et al. Targeted expression of Cre recombinase provokes placental-specific DNA recombination in transgenic mice. PLoS One. 7 (2), e29236 (2012).
  13. Wattez, J. S., Qiao, L., Lee, S., Natale, D. R. C., Shao, J. The platelet-derived growth factor receptor alpha promoter-directed expression of cre recombinase in mouse placenta. Developmental Dynamics. 248 (5), 363-374 (2019).
  14. Nadeau, V., et al. Map2k1 and Map2k2 genes contribute to the normal development of syncytiotrophoblasts during placentation. Development. 136 (8), 1363-1374 (2009).
  15. Chakraborty, D., Muto, M., Soares, M. J. Ex vivo trophoblast-specific genetic manipulation using lentiviral delivery. BioProtocol. 7 (24), e2652 (2017).
  16. Okada, Y., et al. Complementation of placental defects and embryonic lethality by trophoblast-specific lentiviral gene transfer. Nature Biotechnology. 25 (2), 233-237 (2007).
  17. Lecuyer, M., et al. a placental marker of fetal brain defects after in utero alcohol exposure. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 44 (2017).
  18. Jones, H. N., Crombleholme, T., Habli, M. Adenoviral-mediated placental gene transfer of IGF-1 corrects placental insufficiency via enhanced placental glucose transport mechanisms. PLoS One. 8 (9), e74632 (2013).
  19. Jones, H., Crombleholme, T., Habli, M. Regulation of amino acid transporters by adenoviral-mediated human insulin-like growth factor-1 in a mouse model of placental insufficiency in vivo and the human trophoblast line BeWo in vitro. Placenta. 35 (2), 132-138 (2014).
  20. Song, A. J., Palmiter, R. D. Detecting and avoiding problems when using the Cre-lox system. Trends in Genetics. 34 (5), 333-340 (2018).
  21. Chuah, M. K., Collen, D., VandenDriessche, T. Biosafety of adenoviral vectors. Current Gene Therapy. 3 (6), 527-543 (2003).
  22. Evers, B., et al. CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).
  23. Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: Lessons from mouse mutants. Nature Reviews Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).
  24. Elmore, S. A., et al. Histology atlas of the developing mouse placenta. Toxicologic Pathology. 50 (1), 60-117 (2022).
  25. Sferruzzi-Perri, A. N., Sandovici, I., Constancia, M., Fowden, A. L. Placental phenotype and the insulin-like growth factors: Resource allocation to fetal growth. The Journal of Physiology. 595 (15), 5057-5093 (2017).
  26. Agrogiannis, G. D., Sifakis, S., Patsouris, E. S., Konstantinidou, A. E. Insulin-like growth factors in embryonic and fetal growth and skeletal development (Review). Molecular Medicine Reports. 10 (2), 579-584 (2014).
  27. Wang, L., Jiang, H., Brigande, J. V. Gene transfer to the developing mouse inner ear by in vivo electroporation. Journal of Visualized Experiments. (64), e3653 (2012).
  28. Elser, B. A., et al. Combined maternal exposure to cypermethrin and stress affect embryonic brain and placental outcomes in mice. Toxicological Sciences. 175 (2), 182-196 (2020).
  29. Gumusoglu, S. B., et al. Chronic maternal interleukin-17 and autism-related cortical gene expression, neurobiology, and behavior. Neuropsychopharmacology. 45 (6), 1008-1017 (2020).
  30. Liu, F., Huang, L. Electric gene transfer to the liver following systemic administration of plasmid DNA. Gene Therapy. 9 (16), 1116-1119 (2002).
  31. Kalli, C., Teoh, W. C., Leen, E. Introduction of genes via sonoporation and electroporation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 818, 231-254 (2014).
  32. Wu, W., et al. Efficient in vivo gene editing using ribonucleoproteins in skin stem cells of recessive dystrophic epidermolysis bullosa mouse model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (7), 1660-1665 (2017).
  33. Nakamura, H. . Electroporation and Sonoporation in Developmental Biology. , (2009).
  34. Bond, A. M., et al. Differential timing and coordination of neurogenesis and astrogenesis in developing mouse hippocampal subregions. Brain Sciences. 10 (12), 909 (2020).
  35. Kojima, Y., Tam, O. H., Tam, P. P. Timing of developmental events in the early mouse embryo. Seminars in Cell & Developmental Biology. 34, 65-75 (2014).
  36. Pennington, K. A., Schlitt, J. M., Schulz, L. C. Isolation of primary mouse trophoblast cells and trophoblast invasion assay. Journal of Visualized Experiments. (59), e3202 (2012).
  37. Mandegar, M. A., et al. CRISPR Interference efficiently induces specific and reversible gene silencing in human iPSCs. Cell Stem Cell. 18 (4), 541-553 (2016).
  38. Dai, Z., et al. Inducible CRISPRa screen identifies putative enhancers. Journal of Genetics and Genomics. 48 (10), 917-927 (2021).
  39. Ursini, G., et al. Placental genomic risk scores and early neurodevelopmental outcomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. (7), e2019789118 (2021).
  40. Smajdor, A. Ethical challenges in fetal surgery. Journal of Medical Ethics. 37 (2), 88-91 (2011).
  41. Antiel, R. M. Ethical challenges in the new world of maternal-fetal surgery. Seminars in Perinatology. 40 (4), 227-233 (2016).

Play Video

Citer Cet Article
Carver, A. J., Taylor, R. J., Stevens, H. E. Mouse In Vivo Placental Targeted CRISPR Manipulation. J. Vis. Exp. (194), e64760, doi:10.3791/64760 (2023).

View Video