Análisis de la afluencia de calcio inducida por receptores de células T en células T murinas primarias mediante citometría de flujo de espectro completo

La afluencia de calcio inducida por receptores de células T (TCR) es una medida útil de la activación de células T y se usa con frecuencia para determinar si una población de células T tiene respuestas deterioradas en los pasos proximales de la vía de señalización TCR¹. Las mediciones de la afluencia de calcio generalmente se realizan marcando previamente las células T con uno o un par de colorantes indicadores fluorescentes de calcio, y luego examinando las señales fluorescentes utilizando citometría de flujo en tiempo real después de la reticulación TCR ^2,3,4. Indo-1, un colorante de calcio métrico de relación, es excitado por el láser UV con emisiones máximas en dos longitudes de onda diferentes dependiendo de la unión al calcio⁵, y es un colorante indicador comúnmente utilizado para el análisis de citometría de flujo de las respuestas de calcio en linfocitos vivos. Como el perfil de emisión de Indo-1 es bastante amplio, puede ser difícil combinar la evaluación de Indo-1 con el análisis simultáneo de múltiples marcadores de superficie celular mediante citometría de flujo de paso de banda. Esta limitación restringe la utilización del análisis de citometría de flujo de las respuestas de calcio a poblaciones prepurificadas de células T o a poblaciones identificadas por un conjunto limitado de moléculas de superficie celular.

Para abordar las limitaciones de medir las respuestas de calcio en poblaciones heterogéneas de linfocitos primarios mediante citometría de flujo de paso de banda, se desarrolló un protocolo para medir la fluorescencia Indo-1 mediante citometría de flujo de espectro completo. Este método permite multiplexar Indo-1 con paneles de anticuerpos dirigidos a moléculas de la superficie celular, aprovechando las capacidades altamente flexibles de la citometría de flujo de espectro completo. La ventaja de utilizar la citometría de flujo de espectro completo sobre la citometría de flujo convencional es su capacidad para distinguir las señales fluorescentes de colorantes altamente superpuestos, aumentando así el número de marcadores de superficie que se pueden evaluar simultáneamente en cada muestra. La citometría de flujo convencional utiliza filtros de paso de banda y está restringida a un fluorocromo por sistema detector⁶. La citometría de flujo de espectro completo recoge señales en todo el espectro del fluorocromo utilizando 64 detectores en un sistema de citometría de flujo espectral de cinco^{láseres 7,8}. Además, la citometría de flujo de espectro completo aprovecha los detectores APD (Avalanche Photo Diode) que tienen una mayor sensibilidad en relación con los detectores de tubos fotomultiplicadores presentes en los citómetros de flujo convencionales⁸. En consecuencia, este enfoque es ideal para las poblaciones de células heterogéneas, como las células mononucleares de sangre periférica o las suspensiones murinas de células de órganos linfoides secundarios, ya que elimina la necesidad de aislar poblaciones específicas de células T antes del marcado del colorante de calcio. En cambio, los perfiles de expresión del marcador de superficie celular y la activación por citometría de flujo después de la recopilación de datos se pueden usar para evaluar las respuestas al calcio en cada población de interés. Como se muestra en este informe, Indo-1 se puede combinar fácilmente con ocho anticuerpos conjugados con fluorocromo, lo que resulta en un total de 10 firmas espectrales únicas. Además, este método se puede aplicar fácilmente a mezclas de células de líneas de ratón congénicamente distintas, lo que permite el análisis simultáneo de las respuestas de calcio en células T de tipo salvaje en comparación con las de una línea de ratón dirigida a genes.