全谱流式细胞术分析原代小鼠T细胞受体诱导的钙内流

T细胞受体（TCR）诱导的钙内流是T细胞活化的有用指标，通常用于确定T细胞群在TCR信号通路¹的近端步骤中是否具有受损的反应。钙内流的测量通常通过用一种或一对荧光钙指示剂染料预先标记T细胞来进行，然后在TCR交联²，^3，4后使用流式细胞术实时检查荧光信号。Indo-1是一种比例法钙染料，由紫外激光激发，在取决于钙结合⁵的两个不同波长处具有峰值发射，并且是流式细胞术分析活淋巴细胞中钙反应的常用指示染料。由于Indo-1的发射曲线相当广泛，因此将Indo-1评估与通过带通流式细胞术同时分析多个细胞表面标志物相结合可能具有挑战性。这种限制限制了流式细胞术对预纯化的T细胞群或由一组有限的细胞表面分子鉴定的细胞群的钙反应分析的使用。

为了解决使用带通流式细胞术测量原代淋巴细胞异质群体的钙反应的局限性，开发了一种使用全光谱流式细胞术测量Indo-1荧光的方案。该方法允许利用全光谱流式细胞术的高度灵活性，将Indo-1与针对细胞表面分子的抗体组合进行多重分析。与传统流式细胞术相比，使用全光谱流式细胞术的优势在于它能够区分荧光信号和高度重叠的染料，从而增加每个样品中可同时评估的表面标志物的数量。常规流式细胞术使用带通滤光片，并且每个^{检测器系统}限制为一种荧光染料6。全光谱流式细胞术使用五激光光谱流式细胞术^系统7，8上的64个检测器收集荧光染料整个光谱的信号。此外，全光谱流式细胞术利用了APD（雪崩光电二极管）检测器，与传统流式^细胞仪8上的光电倍增管检测器相比，APD（Avalanche 光电二极管）检测器的灵敏度更高。因此，这种方法是异质细胞群的理想选择，例如外周血单核细胞或鼠次级淋巴器官细胞悬液，因为它消除了在钙染料标记之前分离特定T细胞群的需要。相反，数据收集后的细胞表面标志物表达谱和流式细胞术门控可用于评估每个目标群体中的钙反应。如本报告所示，Indo-1 可以很容易地与八种荧光染料偶联抗体结合，从而产生总共 10 种独特的光谱特征。此外，该方法可以很容易地应用于来自同源不同小鼠系的细胞混合物，允许与来自基因靶向小鼠系的细胞相比同时分析野生型T细胞中的钙反应。