Summary

Препарат, характеристики, токсичность и оценка эффективности назальной самоорганизующейся наноэмульсионной противоопухолевой вакцины in vitro и in vivo

Published: September 28, 2022
doi:

Summary

Здесь мы представляем подробные методы приготовления и оценки назальной самоорганизующейся наноэмульсионной противоопухолевой вакцины in vitro и in vivo.

Abstract

Эпитопные пептиды привлекли широкое внимание в области противоопухолевых вакцин из-за их безопасности, высокой специфичности и удобного производства; в частности, некоторые эпитопы, ограниченные MHC I, могут индуцировать эффективную активность цитотоксических Т-лимфоцитов для очистки опухолевых клеток. Кроме того, назальное введение является эффективным и безопасным методом доставки опухолевых вакцин из-за его удобства и улучшенной комплаентности пациентов. Однако эпитопные пептиды непригодны для назальной доставки из-за их плохой иммуногенности и недостаточной эффективности доставки. Наноэмульсии (НЭ) представляют собой термодинамически стабильные системы, которые могут быть загружены антигенами и доставлены непосредственно на поверхность слизистой оболочки носа. Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV) является основным пентапептидом ламинина, интегринсвязывающего пептида, экспрессируемого респираторными эпителиальными клетками человека. В этом исследовании методом низкоэнергетического эмульгирования была получена интраназальная самоорганизующаяся эпитопная пептидная пептидная опухолевая вакцина NE, содержащая синтетический пептид IKVAV-OVA257-264 (I-OVA ). Комбинация IKVAV и OVA257-264 может усиливать поглощение антигена эпителиальными клетками слизистой оболочки носа. Здесь мы устанавливаем протокол для изучения физико-химических характеристик с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ), атомно-силовой микроскопии (АСМ) и динамического рассеяния света (DLS); стабильность в присутствии белка муцина; токсичность путем изучения жизнеспособности клеток BEAS-2B, а также тканей носа и легких мышей C57BL/6; клеточное поглощение с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM); профили высвобождения путем визуализации мелких животных in vivo; и защитный и терапевтический эффект вакцины с использованием модели E.G7, несущей опухоль. Мы ожидаем, что протокол предоставит технические и теоретические подсказки для будущей разработки новых Т-клеточных эпитопных пептидных вакцин для слизистых оболочек.

Introduction

Являясь одной из наиболее важных инноваций в области общественного здравоохранения, вакцины играют ключевую роль в борьбе с глобальным бременем болезней человека1. Например, в настоящее время тестируется более 120 вакцин-кандидатов от болезней COVID-19, некоторые из которых были одобрены во многих странах2. В недавних сообщениях говорится, что противораковые вакцины эффективно улучшили прогресс клинического лечения рака, поскольку они направляют иммунную систему больных раком на распознавание антигенов как чужеродных для организма3. Кроме того, множественные Т-клеточные эпитопы, расположенные внутри или снаружи опухолевых клеток, могут быть использованы для разработки пептидных вакцин, которые показали преимущества в лечении метастатического рака из-за отсутствия значительной токсичности, связанной с лучевой терапией и химиотерапией 4,5. С середины 1990-х годов доклинические и клинические испытания для лечения опухолей проводились в основном с использованием антигенных пептидных вакцин, но лишь немногие вакцины проявляют адекватный терапевтический эффект у онкологических больных6. Кроме того, противораковые вакцины с пептидными эпитопами имеют плохую иммуногенность и недостаточную эффективность доставки, что может быть связано с быстрой деградацией внеклеточных пептидов, которые быстро диффундируют от места введения, что приводит к недостаточному поглощению антигена иммунными клетками7. Поэтому необходимо преодолевать эти препятствия с помощью технологии доставки вакцин.

OVA 257-264, MHC класс I-связывающий эпитоп257-264, экспрессируемый в виде слитого белка, является часто используемым модельным эпитопом8. Кроме того, OVA257-264 имеет решающее значение для адаптивного иммунного ответа против опухолей, который зависит от ответа цитотоксического Т-лимфоцита (CTL). Он опосредован антиген-специфическими CD8+ Т-клетками в опухоли, которые индуцируются пептидом OVA257-264 . Характеризуется недостаточным количеством гранзима В, который высвобождается цитотоксическими Т-клетками, что приводит к апоптозу клеток-мишеней8. Однако введение свободного пептида OVA257-264 может вызывать небольшую активность CTL, поскольку поглощение этих антигенов происходит в неспецифических клетках, а не в антигенпрезентирующих клетках (APC). Дефицит соответствующей иммунной стимуляции приводит к активности CTL5. Следовательно, индукция эффективной активности CTL требует значительного прогресса.

Благодаря барьеру, обеспечиваемому эпителиальными клетками, и непрерывной секреции слизи вакцинные антигены быстро удаляются из слизистой оболочки носа 9,10. Разработка эффективного вакцинного вектора, который может проходить через ткань слизистой оболочки, имеет решающее значение, поскольку антигенпрезентирующие клетки расположены под эпителиемслизистой оболочки 9. Интраназальное введение вакцин теоретически индуцирует иммунитет слизистой оболочки для борьбы с инфекцией слизистой оболочки11. Кроме того, назальная доставка является эффективным и безопасным методом введения вакцин из-за ее удобства, предотвращения кишечного введения и улучшения комплаентности пациентов7. Таким образом, назальная доставка является хорошим средством введения новой пептидной эпитопной нановакцины.

Было разработано несколько синтетических биоматериалов для объединения эпитопов межклеточных и клеточных взаимодействий. Некоторые биологически активные белки, такие как Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV), были введены как часть структуры гидрогеля для придания биологической активности12. Этот пептид, вероятно, способствует прикреплению, миграции и ростуклеток 13 и связывает интегрины α 3β1 и α6β1 для взаимодействия с различными типами раковых клеток. IKVAV представляет собой пептид клеточной адгезии, полученный из белка базальной мембраны ламинина αцепи 1, который первоначально использовался для моделирования нейронного микроокружения и вызывания дифференцировки нейронов14. Поэтому поиск эффективного средства доставки этой новой вакцины важен для борьбы с болезнью.

Недавно зарегистрированные эмульсионные системы, такие как W805EC и MF59, также были составлены для доставки в нос инактивированной вакцины против гриппа или рекомбинантного поверхностного антигена гепатита В и проиллюстрированы как запускающие как слизистый, так и системный иммунитет15. Наноэмульсии (НЭ) обладают такими преимуществами, как простота введения и удобное совместное образование с эффективными адъювантами по сравнению с системами доставки слизистой оболочки твердых частиц16. Сообщалось, что наноэмульсионные вакцины изменяют аллергический фенотип устойчивым образом, отличным от традиционной десенсибилизации, что приводит к долгосрочным подавляющим эффектам17. Другие сообщили, что наноэмульсии в сочетании с Mtb-специфическими иммунодоминантными антигенами могут индуцировать мощные реакции клеток слизистой оболочки и обеспечивать значительную защиту18. Поэтому была разработана новая интраназальная самоорганизующаяся нановакцина с синтетическим пептидом IKVAV-OVA 257-264 (I-OVA, пептид, состоящий из IKVAV, связанного с OVA257-264). Важно систематически оценивать эту новую нановакцину.

Целью этого протокола является систематическая оценка физико-химических характеристик, токсичности и стабильности нановакцины, определение того, усиливается ли поглощение антигена, а также защитные и терапевтические эффекты с помощью технических средств, и уточнение основного содержания эксперимента. В этом исследовании мы установили ряд протоколов для изучения физико-химических характеристик и стабильности, определения величины токсичности клеток I-OVA NE to BEAS-2B с помощью CCK-8 и наблюдения за антигенпрезентирующей способностью клеток BEAS-2B к вакцине с помощью конфокальной микроскопии, оценки профилей высвобождения этой новой нановакцины in vivo и in vitroи определить защитный и терапевтический эффект этой вакцины с помощью модели мыши с опухолью E.G7-OVA.

Protocol

Эксперименты на животных проводились в соответствии с Руководством по этической экспертизе благополучия животных на лабораторных животных (GB/T 35892-2018) и были одобрены Комитетом по благополучию и этике лабораторных животных Третьего военно-медицинского университета. Мышей усыпляли вн…

Representative Results

В соответствии с протоколом мы завершили подготовку и экспериментальную оценку in vitro и in vivo доставки нановакцины против опухоли носа. TEM, AFM и DLS являются эффективными средствами для оценки основных характеристик поверхностного дзета-потенциала и размера частиц нановакцины (<st…

Discussion

Нановакцины, функционализированные мембранами иммуноцитов, имеют большие преимущества в терапии, направленной на болезнь, а побочные эффекты сводятся к минимуму благодаря таким свойствам, как уникальный опухолевый тропизм, идентификация специфических мишеней, длительная циркуляция…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Это исследование было поддержано No 31670938, 32070924, 32000651 Программы Национального фонда естественных наук Китая, No 2014jcyjA0107 и No 2019jcyjA-msxmx0159 Проектной программы Фонда естественных наук Чунцина, No 2020XBK24 и No 2020XBK26 специальных проектов Армейского медицинского университета, а также No 202090031021 и No 202090031035 Национальной программы инноваций и предпринимательства для студентов колледжей.

Materials

96-well plates Corning Incorporated, USA CLS3922
Bio-Rad 6.0 microplate reader Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA  Bio-Rad 6.0
CCK-8 kits Dojindo, Japan CK04
Centrifuge 5810 R Eppendorf, Germany  5811000398
DAPI Sigma-Aldrich, St. Louis, USA D9542
fetal bovine serum (FBS) Hyclone (Life Technology, USA) SH30088.03
FITC-labeled I-OVA Shanghai Botai
Biotechnology Co., Ltd.
NA
HF 90/240 Incubator Heal Force, Switzerland NA
HPLC  Shanghai Botai Biotechology Co., Ltd. E2695
Inverted Microscope Nikon,Japan DSZ5000X
IPC-208 Chong Qing University, China NA
IVIS system  Caliper Life Science Limited Company NA
JEM-1230 TEM JEOL Limited Company of Japan 1230 TEM
Malvern NANO ZS Malvern Instruments Ltd., UK NA
MPLA  Invivogen
Lit. Co.
tlrl-mpla
Neomycin Sulfate Ointment Shanghai CP General Pharmaceutical Co. , Ltd. H31022262
OVA257–264 Shanghai Botai
Biotechnology Co., Ltd.
NA
RPMI 1640 medium Hyclone (Life Technology, USA) SH30809.01
Synthetic peptide (I-OVA) conjugation of IKVAV-PA Shanghai Botai
Biotechnology Co., Ltd.
NA
Zeiss LSM800 laser scanning confocal fluorescence microscope Zeiss, Germany Zeiss LSM800

References

  1. Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
  2. Mohammed, I., et al. The efficacy and effectiveness of the COVID-19 vaccines in reducing infection, severity, hospitalization, and mortality: A systematic review. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 18 (1), 2027160 (2022).
  3. Tsung, K., Norton, J. A. In situ vaccine, immunological memory and cancer cure. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 12 (1), 117-119 (2016).
  4. Abd-Aziz, N., Poh, C. L., Ding, X. Development of peptide-based vaccines for cancer. Journal of Oncology. 2022, 9749363 (2022).
  5. Mochizuki, S., et al. Immunization with antigenic peptides complexed with beta-glucan induces potent cytotoxic T-lymphocyte activity in combination with CpG-ODNs. Journal of Controlled Release. 220, 495-502 (2015).
  6. Kalita, P., Tripathi, T. Methodological advances in the design of peptide-based vaccines. Drug Discovery Today. 27 (5), 1367-1380 (2022).
  7. Yang, Y., et al. A novel self-assembled epitope peptide nanoemulsion vaccine targeting nasal mucosal epithelial cell for reinvigorating CD8(+) T cell immune activity and inhibiting tumor progression. International Journal of Biological Macromolecules. 183, 1891-1902 (2021).
  8. Ren, Y., et al. OVA-specific CD8+ T cells do not express granzyme B during anterior chamber associated immune deviation. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 244 (10), 1315-1321 (2006).
  9. Suzuki, K., et al. Preparation of hyaluronic acid-coated polymeric micelles for nasal vaccine delivery. Biomaterials Science. 10 (8), 1920-1928 (2022).
  10. Georas, S. N., Rezaee, F. Epithelial barrier function: at the front line of asthma immunology and allergic airway inflammation. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134 (3), 509-520 (2014).
  11. Lam, J. Y., et al. A nasal omicron vaccine booster elicits potent neutralizing antibody response against emerging SARS-CoV-2 variants. Emerging Microbes & Infections. 11 (1), 964-967 (2022).
  12. Chai, Y., et al. Improved functional recovery of rat transected spinal cord by peptide-grafted PNIPAM based hydrogel. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 210, 112220 (2022).
  13. Paiva Dos Santos, B., et al. Production, purification and characterization of an elastin-like polypeptide containing the Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV) peptide for tissue engineering applications. Journal of Biotechnology. 298, 35-44 (2019).
  14. Okur, A. C., Erkoc, P., Kizilel, S. Targeting cancer cells via tumor-homing peptide CREKA functional PEG nanoparticles. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 147, 191-200 (2016).
  15. Makidon, P. E., et al. Pre-clinical evaluation of a novel nanoemulsion-based hepatitis B mucosal vaccine. PLoS One. 3 (8), 2954 (2008).
  16. Lin, X., et al. Oil-in-ionic liquid nanoemulsion-based intranasal delivery system for influenza split-virus vaccine. Journal of Controlled Release. 346, 380-391 (2022).
  17. O’Konek, J. J., et al. Intranasal nanoemulsion vaccine confers long-lasting immunomodulation and sustained unresponsiveness in a murine model of milk allergy. Allergy. 75 (4), 872-881 (2020).
  18. Ahmed, M., et al. A novel nanoemulsion vaccine induces mucosal Interleukin-17 responses and confers protection upon Mycobacterium tuberculosis challenge in mice. Vaccine. 35 (37), 4983-4989 (2017).
  19. Sun, H., et al. Induction of systemic and mucosal immunity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection by a novel nanoemulsion adjuvant vaccine. International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015).
  20. Chen, C., et al. Tumor-associated-macrophage-membrane-coated nanoparticles for improved photodynamic immunotherapy. Nano Letters. 21 (13), 5522-5531 (2021).
  21. Prasanna, P., et al. Current status of nanoscale drug delivery and the future of nano-vaccine development for leishmaniasis – A review. Biomedicine & Pharmacotherapy. 141, 111920 (2021).
  22. George, S., et al. Surface defects on plate-shaped silver nanoparticles contribute to its hazard potential in a fish gill cell line and zebrafish embryos. ACS Nano. 6 (5), 3745-3759 (2012).
  23. Jafari Eskandari, M., Gostariani, R., Asadi Asadabad, M., Singh, D., Condurache-Bota, S. Transmission Electron Microscopy of Nanomaterials. Electron Crystallography. , (2020).
  24. Kontomaris, S. V., Stylianou, A., Malamou, A. Atomic force microscopy nanoindentation method on collagen fibrils. Materials. 15 (7), 2477 (2022).
  25. Zielinska, A., et al. Polymeric nanoparticles: Production, characterization, toxicology and ecotoxicology. Molecules. 25 (16), 3731 (2020).
  26. Doncom, K. E. B., Blackman, L. D., Wright, D. B., Gibson, M. I., O’Reilly, R. K. Dispersity effects in polymer self-assemblies: A matter of hierarchical control. Chemical Society Reviews. 46 (14), 4119-4134 (2017).
  27. Pei, M., Li, H., Zhu, Y., Lu, J., Zhang, C. In vitro evidence of oncofetal antigen and TLR-9 agonist co-delivery by alginate nanovaccines for liver cancer immunotherapy. Biomaterials Science. 10 (11), 2865-2876 (2022).
  28. Zhang, J., et al. Titanium dioxide nanoparticles induced reactive oxygen species (ROS) related changes of metabolomics signatures in human normal bronchial epithelial (BEAS-2B) cells. Toxicology and Applied Pharmacology. 444, 116020 (2022).
  29. Kumar, V., Sharma, N., Maitra, S. S. In vitro and in vivo toxicity assessment of nanoparticles. International Nano Letters. 7 (4), 243-256 (2017).
  30. Tong, Y. N., et al. An immunopotentiator, ophiopogonin D, encapsulated in a nanoemulsion as a robust adjuvant to improve vaccine efficacy. Acta Biomaterialia. 77, 255-267 (2018).
  31. Elliott, A. D. Confocal microscopy: Principles and modern practices. Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).
  32. Huang, Y., Zou, Y., Lin, L., Zheng, R. Ginsenoside Rg1 activates dendritic cells and acts as a vaccine adjuvant inducing protective cellular responses against lymphomas. DNA and Cell Biology. 36 (12), 1168-1177 (2017).

Play Video

Citer Cet Article
Zhang, Z., Cai, D., Ge, S., Luo, X., Zeng, X., Ye, Y., Song, Z., Peng, L., Li, H., Zou, Q., Zeng, H., Sun, H., Yang, Y. Preparation, Characteristics, Toxicity, and Efficacy Evaluation of the Nasal Self-Assembled Nanoemulsion Tumor Vaccine In Vitro and In Vivo. J. Vis. Exp. (187), e64299, doi:10.3791/64299 (2022).

View Video