Summary

Voorbereiding, kenmerken, toxiciteit en werkzaamheid Evaluatie van het nasale zelfgeassembleerde nano-emulsietumorvaccin in vitro en in vivo

Published: September 28, 2022
doi:

Summary

Hier presenteren we gedetailleerde methoden voor de bereiding en evaluatie van het nasale zelfgeassembleerde nano-emulsietumorvaccin in vitro en in vivo.

Abstract

Epitooppeptiden hebben wijdverspreide aandacht getrokken op het gebied van tumorvaccins vanwege hun veiligheid, hoge specificiteit en handige productie; in het bijzonder kunnen sommige MHC I-beperkte epitopen effectieve cytotoxische T-lymfocytenactiviteit induceren om tumorcellen te verwijderen. Bovendien is nasale toediening een effectieve en veilige toedieningstechniek voor tumorvaccins vanwege het gemak en de verbeterde therapietrouw van de patiënt. Epitopeptiden zijn echter niet geschikt voor nasale bevalling vanwege hun slechte immunogeniciteit en gebrek aan leveringsefficiëntie. Nano-emulsies (NEs) zijn thermodynamisch stabiele systemen die kunnen worden geladen met antigenen en rechtstreeks op het neusslijmvliesoppervlak kunnen worden afgeleverd. Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV) is het kernpentapeptide van laminine, een integrinebindend peptide dat tot expressie wordt gebracht door menselijke respiratoire epitheelcellen. In deze studie werd een intranasaal zelfgeassembleerd epitooppeptide NE-tumorvaccin met het synthetische peptide IKVAV-OVA257-264 (I-OVA ) bereid met een laagenergetische emulgeringsmethode. De combinatie van IKVAV en OVA257-264 kan de opname van antigeen door nasale mucosale epitheelcellen verbeteren. Hier stellen we een protocol op om de fysisch-chemische kenmerken te bestuderen door transmissie-elektronenmicroscopie (TEM), atoomkrachtmicroscopie (AFM) en dynamische lichtverstrooiing (DLS); stabiliteit in aanwezigheid van mucine-eiwit; toxiciteit door onderzoek naar de levensvatbaarheid van de cellen van BEAS-2B-cellen en de neus- en longweefsels van C57BL/6-muizen; cellulaire opname door confocale laserscanmicroscopie (CLSM); vrijgaveprofielen door kleine dieren in vivo in beeld te brengen; en het beschermende en therapeutische effect van het vaccin door gebruik te maken van een E.G7 tumordragend model. We verwachten dat het protocol technische en theoretische aanwijzingen zal bieden voor de toekomstige ontwikkeling van nieuwe T-cel epitoop peptide mucosale vaccins.

Introduction

Als een van de meest kritieke innovaties op het gebied van de volksgezondheid spelen vaccins een sleutelrol in de strijd tegen de wereldwijde last van menselijke ziekten1. Op dit moment worden bijvoorbeeld meer dan 120 kandidaat-vaccins voor COVID-19-ziekten getest, waarvan sommige in veel landen zijn goedgekeurd2. Recente rapporten stellen dat kankervaccins de voortgang van klinische kankerbehandelingen effectief hebben verbeterd omdat ze het immuunsysteem van kankerpatiënten sturen om antigenen te herkennen als lichaamsvreemd3. Bovendien kunnen meerdere T-cel epitopen binnen of buiten tumorcellen worden gebruikt om peptidevaccins te ontwerpen, die voordelen hebben aangetoond bij de behandeling van gemetastaseerde kankers vanwege het ontbreken van de significante toxiciteit geassocieerd met radiotherapie en chemotherapie 4,5. Sinds het midden van de jaren 1990 zijn preklinische en klinische proeven voor tumorbehandeling voornamelijk uitgevoerd met behulp van antigeenpeptidevaccins, maar weinig vaccins vertonen een adequaat therapeutisch effect op kankerpatiënten6. Bovendien hebben kankervaccins met peptide-epitopen een slechte immunogeniciteit en onvoldoende leveringsefficiëntie, wat te wijten kan zijn aan de snelle afbraak van extracellulaire peptiden die snel diffunderen vanaf de plaats van toediening, wat leidt tot onvoldoende antigeenopname door immuuncellen7. Daarom is het noodzakelijk om deze obstakels te overwinnen met vaccinafgiftetechnologie.

OVA 257-264, het MHC klasse I-bindende257-264 epitoop uitgedrukt als een fusie-eiwit, is een veelgebruikt model epitoop8. Bovendien is OVA257-264 cruciaal voor de adaptieve immuunrespons tegen tumoren, die afhankelijk is van de cytotoxische T-lymfocytenrespons (CTL). Het wordt gemedieerd door antigeenspecifieke CD8 + T-cellen in de tumor, die worden geïnduceerd door het OVA257-264-peptide . Het wordt gekenmerkt door onvoldoende granzyme B, dat wordt vrijgegeven door cytotoxische T-cellen, wat leidt tot de apoptose van doelcellen8. Vrije toediening van OVA257-264-peptiden kan echter weinig CTL-activiteit induceren omdat de opname van deze antigenen plaatsvindt in niet-specifieke cellen in plaats van antigeen-presenterende cellen (APC’s). Het tekort aan geschikte immuunstimulatie resulteert in CTL-activiteit5. Daarom vereist de inductie van effectieve CTL-activiteit aanzienlijke vooruitgang.

Vanwege de barrière van epitheelcellen en de continue afscheiding van slijm, worden vaccinantigenen snel verwijderd uit het neusslijm 9,10. Het ontwikkelen van een efficiënte vaccinvector die door het slijmvliesweefsel kan gaan, is cruciaal omdat de antigeen-presenterende cellen zich onder het mucosale epitheel9 bevinden. Intranasale injectie van vaccins induceert theoretisch mucosale immuniteit om mucosale infectie te bestrijden11. Bovendien is nasale toediening een effectieve en veilige toedieningsmethode voor vaccins vanwege het gemak, het vermijden van darmtoediening en verbeterde patiëntcompliancy7. Daarom is nasale toediening een goed toedieningsmiddel voor het nieuwe peptide epitoop nanovaccin.

Verschillende synthetische biomaterialen zijn ontworpen om epitopen van cel-weefsel en cel-cel interacties te combineren. Bepaalde bioactieve eiwitten, zoals Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV), zijn geïntroduceerd als onderdeel van de structuur van de hydrogel om bioactiviteitte verlenen 12. Dit peptide draagt waarschijnlijk bij aan celaanhechting, migratie en uitgroei13 en bindt integrinen α 3β1 en α6β1 om te interageren met verschillende kankerceltypen. IKVAV is een celadhesiepeptide afgeleid van het laminine keldermembraaneiwit α1-keten dat oorspronkelijk werd gebruikt om de neurale micro-omgeving te modelleren en de neuronale differentiatiete veroorzaken 14. Daarom is het vinden van een efficiënt leveringsmiddel voor dit nieuwe vaccin belangrijk voor ziektebestrijding.

Recent gerapporteerde emulsiesystemen, zoals W805EC en MF59, zijn ook samengesteld voor de toediening van de neusholte van geïnactiveerd influenzavaccin of recombinant hepatitis B-oppervlakteantigeen en geïllustreerd om zowel mucosale als systemische immuniteit te activeren15. Nano-emulsies (NE’s) hebben de voordelen van eenvoudige toediening en gemakkelijke co-vorming met effectieve adjuvantia in vergelijking met deeltjesslijmvliesafgiftesystemen16. Van nano-emulsievaccins is gemeld dat ze het allergische fenotype op een duurzame manier veranderen die verschilt van traditionele desensibilisatie, wat resulteert in langdurige onderdrukkende effecten17. Anderen meldden dat nano-emulsies in combinatie met Mtb-specifieke immunodominante antigenen krachtige mucosale celresponsen konden induceren en significante bescherming konden bieden18. Daarom werd een nieuw intranasaal zelfgeassembleerd nanovaccin met het synthetische peptide IKVAV-OVA 257-264 (I-OVA, het peptide bestaande uit IKVAV gebonden aan OVA257-264) ontworpen. Het is belangrijk om dit nieuwe nanovaccin systematisch te beoordelen.

Het doel van dit protocol is om systematisch de fysisch-chemische kenmerken, toxiciteit en stabiliteit van het nanovaccin te evalueren, te detecteren of de opname van antigeen en beschermende en therapeutische effecten worden versterkt met behulp van technische middelen, en de belangrijkste experimentele inhoud uit te werken. In deze studie hebben we een reeks protocollen opgesteld om de fysisch-chemische kenmerken en stabiliteit te bestuderen, de omvang van de toxiciteit van de I-OVA NE voor BEAS-2B-cellen door CCK-8 te bepalen en het antigeen-presenterende vermogen van BEAS-2B-cellen voor het vaccin te observeren met behulp van confocale microscopie, de afgifteprofielen van dit nieuwe nanovaccin in vivo en in vitro te evalueren, en detecteer het beschermende en therapeutische effect van dit vaccin met behulp van een E.G7-OVA tumordragend muismodel.

Protocol

De dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de Proefdierrichtlijn voor ethische beoordeling van dierenwelzijn (GB/T 35892-2018) en werden goedgekeurd door de Laboratoriumcommissie Dierenwelzijn en Ethiek van de Derde Militaire Medische Universiteit. De muizen werden geëuthanaseerd door een intraperitoneale injectie van 100 mg/kg 1% natriumpentobarbital. 1. Voorbereiding van de I-OVA NE Meng 1 mg monofosforyllipide A (MPLA) met 100 μL DMSO, vortex gedur…

Representative Results

Volgens het protocol voltooiden we de voorbereiding en in vitro en in vivo experimentele evaluatie van de nasale tumornanovaccinafgifte. TEM, AFM en DLS zijn effectieve middelen voor de beoordeling van de basiskenmerken van het oppervlaktezetapotentiaal en de deeltjesgrootte van het nanovaccin (figuur 1). BEAS-2B-epitheelcellen zijn een nuttig screeningsmodel voor het in vitro toxiciteitsonderzoek van nasale vaccins (figuur 2A). De mic…

Discussion

Nanovaccins gefunctionaliseerd met immunocytenmembranen hebben grote voordelen bij ziektegerichte therapie en de bijwerkingen worden geminimaliseerd door eigenschappen zoals uniek tumortropisme, de identificatie van specifieke doelen, langdurige circulatie, verbeterde intercellulaire interacties en lage systemische toxiciteit. Ze kunnen ook gemakkelijk worden geïntegreerd met andere behandelingsmodules om kankers coöperatief te behandelen16,20. Wenselijke eigen…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Deze studie werd ondersteund door nr. 31670938, 32070924, 32000651 van het National Natural Science Foundation Program of China, nr. 2014jcyjA0107 en nr. 2019jcyjA-msxmx0159 van het Natural Science Foundation Project Program van Chongqing, nr. 2020XBK24 en nr. 2020XBK26 van de Army Medical University Special-projecten, en nr. 202090031021 en nr. 202090031035 van het National Innovation and Entrepreneurship Program voor studenten.

Materials

96-well plates Corning Incorporated, USA CLS3922
Bio-Rad 6.0 microplate reader Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA  Bio-Rad 6.0
CCK-8 kits Dojindo, Japan CK04
Centrifuge 5810 R Eppendorf, Germany  5811000398
DAPI Sigma-Aldrich, St. Louis, USA D9542
fetal bovine serum (FBS) Hyclone (Life Technology, USA) SH30088.03
FITC-labeled I-OVA Shanghai Botai
Biotechnology Co., Ltd.
NA
HF 90/240 Incubator Heal Force, Switzerland NA
HPLC  Shanghai Botai Biotechology Co., Ltd. E2695
Inverted Microscope Nikon,Japan DSZ5000X
IPC-208 Chong Qing University, China NA
IVIS system  Caliper Life Science Limited Company NA
JEM-1230 TEM JEOL Limited Company of Japan 1230 TEM
Malvern NANO ZS Malvern Instruments Ltd., UK NA
MPLA  Invivogen
Lit. Co.
tlrl-mpla
Neomycin Sulfate Ointment Shanghai CP General Pharmaceutical Co. , Ltd. H31022262
OVA257–264 Shanghai Botai
Biotechnology Co., Ltd.
NA
RPMI 1640 medium Hyclone (Life Technology, USA) SH30809.01
Synthetic peptide (I-OVA) conjugation of IKVAV-PA Shanghai Botai
Biotechnology Co., Ltd.
NA
Zeiss LSM800 laser scanning confocal fluorescence microscope Zeiss, Germany Zeiss LSM800

References

  1. Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
  2. Mohammed, I., et al. The efficacy and effectiveness of the COVID-19 vaccines in reducing infection, severity, hospitalization, and mortality: A systematic review. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 18 (1), 2027160 (2022).
  3. Tsung, K., Norton, J. A. In situ vaccine, immunological memory and cancer cure. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 12 (1), 117-119 (2016).
  4. Abd-Aziz, N., Poh, C. L., Ding, X. Development of peptide-based vaccines for cancer. Journal of Oncology. 2022, 9749363 (2022).
  5. Mochizuki, S., et al. Immunization with antigenic peptides complexed with beta-glucan induces potent cytotoxic T-lymphocyte activity in combination with CpG-ODNs. Journal of Controlled Release. 220, 495-502 (2015).
  6. Kalita, P., Tripathi, T. Methodological advances in the design of peptide-based vaccines. Drug Discovery Today. 27 (5), 1367-1380 (2022).
  7. Yang, Y., et al. A novel self-assembled epitope peptide nanoemulsion vaccine targeting nasal mucosal epithelial cell for reinvigorating CD8(+) T cell immune activity and inhibiting tumor progression. International Journal of Biological Macromolecules. 183, 1891-1902 (2021).
  8. Ren, Y., et al. OVA-specific CD8+ T cells do not express granzyme B during anterior chamber associated immune deviation. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 244 (10), 1315-1321 (2006).
  9. Suzuki, K., et al. Preparation of hyaluronic acid-coated polymeric micelles for nasal vaccine delivery. Biomaterials Science. 10 (8), 1920-1928 (2022).
  10. Georas, S. N., Rezaee, F. Epithelial barrier function: at the front line of asthma immunology and allergic airway inflammation. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134 (3), 509-520 (2014).
  11. Lam, J. Y., et al. A nasal omicron vaccine booster elicits potent neutralizing antibody response against emerging SARS-CoV-2 variants. Emerging Microbes & Infections. 11 (1), 964-967 (2022).
  12. Chai, Y., et al. Improved functional recovery of rat transected spinal cord by peptide-grafted PNIPAM based hydrogel. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 210, 112220 (2022).
  13. Paiva Dos Santos, B., et al. Production, purification and characterization of an elastin-like polypeptide containing the Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV) peptide for tissue engineering applications. Journal of Biotechnology. 298, 35-44 (2019).
  14. Okur, A. C., Erkoc, P., Kizilel, S. Targeting cancer cells via tumor-homing peptide CREKA functional PEG nanoparticles. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 147, 191-200 (2016).
  15. Makidon, P. E., et al. Pre-clinical evaluation of a novel nanoemulsion-based hepatitis B mucosal vaccine. PLoS One. 3 (8), 2954 (2008).
  16. Lin, X., et al. Oil-in-ionic liquid nanoemulsion-based intranasal delivery system for influenza split-virus vaccine. Journal of Controlled Release. 346, 380-391 (2022).
  17. O’Konek, J. J., et al. Intranasal nanoemulsion vaccine confers long-lasting immunomodulation and sustained unresponsiveness in a murine model of milk allergy. Allergy. 75 (4), 872-881 (2020).
  18. Ahmed, M., et al. A novel nanoemulsion vaccine induces mucosal Interleukin-17 responses and confers protection upon Mycobacterium tuberculosis challenge in mice. Vaccine. 35 (37), 4983-4989 (2017).
  19. Sun, H., et al. Induction of systemic and mucosal immunity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection by a novel nanoemulsion adjuvant vaccine. International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015).
  20. Chen, C., et al. Tumor-associated-macrophage-membrane-coated nanoparticles for improved photodynamic immunotherapy. Nano Letters. 21 (13), 5522-5531 (2021).
  21. Prasanna, P., et al. Current status of nanoscale drug delivery and the future of nano-vaccine development for leishmaniasis – A review. Biomedicine & Pharmacotherapy. 141, 111920 (2021).
  22. George, S., et al. Surface defects on plate-shaped silver nanoparticles contribute to its hazard potential in a fish gill cell line and zebrafish embryos. ACS Nano. 6 (5), 3745-3759 (2012).
  23. Jafari Eskandari, M., Gostariani, R., Asadi Asadabad, M., Singh, D., Condurache-Bota, S. Transmission Electron Microscopy of Nanomaterials. Electron Crystallography. , (2020).
  24. Kontomaris, S. V., Stylianou, A., Malamou, A. Atomic force microscopy nanoindentation method on collagen fibrils. Materials. 15 (7), 2477 (2022).
  25. Zielinska, A., et al. Polymeric nanoparticles: Production, characterization, toxicology and ecotoxicology. Molecules. 25 (16), 3731 (2020).
  26. Doncom, K. E. B., Blackman, L. D., Wright, D. B., Gibson, M. I., O’Reilly, R. K. Dispersity effects in polymer self-assemblies: A matter of hierarchical control. Chemical Society Reviews. 46 (14), 4119-4134 (2017).
  27. Pei, M., Li, H., Zhu, Y., Lu, J., Zhang, C. In vitro evidence of oncofetal antigen and TLR-9 agonist co-delivery by alginate nanovaccines for liver cancer immunotherapy. Biomaterials Science. 10 (11), 2865-2876 (2022).
  28. Zhang, J., et al. Titanium dioxide nanoparticles induced reactive oxygen species (ROS) related changes of metabolomics signatures in human normal bronchial epithelial (BEAS-2B) cells. Toxicology and Applied Pharmacology. 444, 116020 (2022).
  29. Kumar, V., Sharma, N., Maitra, S. S. In vitro and in vivo toxicity assessment of nanoparticles. International Nano Letters. 7 (4), 243-256 (2017).
  30. Tong, Y. N., et al. An immunopotentiator, ophiopogonin D, encapsulated in a nanoemulsion as a robust adjuvant to improve vaccine efficacy. Acta Biomaterialia. 77, 255-267 (2018).
  31. Elliott, A. D. Confocal microscopy: Principles and modern practices. Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).
  32. Huang, Y., Zou, Y., Lin, L., Zheng, R. Ginsenoside Rg1 activates dendritic cells and acts as a vaccine adjuvant inducing protective cellular responses against lymphomas. DNA and Cell Biology. 36 (12), 1168-1177 (2017).

Play Video

Citer Cet Article
Zhang, Z., Cai, D., Ge, S., Luo, X., Zeng, X., Ye, Y., Song, Z., Peng, L., Li, H., Zou, Q., Zeng, H., Sun, H., Yang, Y. Preparation, Characteristics, Toxicity, and Efficacy Evaluation of the Nasal Self-Assembled Nanoemulsion Tumor Vaccine In Vitro and In Vivo. J. Vis. Exp. (187), e64299, doi:10.3791/64299 (2022).

View Video