यह लेख एमएपी 65, एक पौधे आधारित सूक्ष्मनलिका क्रॉसलिंकर और खूंटी को भीड़ एजेंट के रूप में उपयोग करके टैक्टोइड्स के आकार में सूक्ष्मनलिकाएं असेंबली के गठन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है।
साइटोस्केलेटन सेल के भीतर प्रमुख आंतरिक संगठन और पुन: संगठन के लिए जिम्मेदार है, सभी परिवर्तनों को निर्देशित करने के लिए प्रबंधक के बिना। यह विशेष रूप से माइटोसिस या अर्धसूत्रीविभाजन के दौरान होता है, जहां सूक्ष्मनलिकाएं कोशिका विभाजन के दौरान धुरी बनाती हैं। धुरी कोशिका विभाजन के दौरान आनुवंशिक सामग्री को अलग करने के लिए उपयोग की जाने वाली मशीनरी है। कृत्रिम परिवेशीय में स्व-संगठित स्पिंडल बनाने की दिशा में, हमने हाल ही में सूक्ष्मनलिकाएं से जुड़े प्रोटीन और भीड़ एजेंटों के न्यूनतम सेट के साथ धुरी जैसी विधानसभाओं में सूक्ष्मनलिकाएं पुनर्गठित करने के लिए एक तकनीक विकसित की है। विशेष रूप से, एमएपी 65 का उपयोग किया गया था, जो पौधों से एक एंटीपैरेलल माइक्रोट्यूब्यूल क्रॉसलिंकर है, खमीर से एएसई 1 का एक होमोलॉग और स्तनधारी जीवों से पीआरसी 1 है। यह क्रॉसलिंकर सूक्ष्मनलिकाएं को लंबे, पतले, धुरी जैसी सूक्ष्मनलिकाएं स्व-संगठित विधानसभाओं में व्यवस्थित करता है। ये असेंबली लिक्विड क्रिस्टल टैक्टोइड्स के समान हैं, और सूक्ष्मनलिकाएं मेसोस्केल मेसोजेन के रूप में इस्तेमाल की जा सकती हैं। यहां, प्रोटोकॉल इन सूक्ष्मनलिकाएं टैक्टोइड्स बनाने के साथ-साथ प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके विधानसभाओं के आकार और फोटोब्लीचिंग के बाद प्रतिदीप्ति वसूली का उपयोग करके घटकों की गतिशीलता की विशेषता के लिए प्रस्तुत किए जाते हैं।
माइटोसिस के माध्यम से कोशिका विभाजन जीवन को बनाए रखने के लिए सबसे महत्वपूर्ण जैविक प्रक्रियाओं में से एक है। ट्यूबुलिन डिमर्स से बने सूक्ष्मनलिका फिलामेंट्स, इस प्रक्रिया के आवश्यक संरचनात्मक तत्व हैं। मेटाफ़ेज़ में बनाई गई क्षणिक मशीनरी जब गुणसूत्र कोशिका केंद्र में संरेखित होते हैं, तो इसके आकार के कारण माइटोटिक स्पिंडल कहा जाता है, जो धागे (चित्रा 1 ए) में कवर किए गए करघे के धुरी की तरह है। यह कई जीवों में अच्छी तरह से स्थापित है कि सूक्ष्मनलिकाएं मेटाफ़ेज़ में संघनित गुणसूत्रों को कोशिका के केंद्र में धकेलने और खींचने के लिए उपयोग की जाती हैं, उन्हें संरेखित करती हैं और उन्हें सूक्ष्मनलिकाएं तक हुक करती हैं जो उन्हें एनाफ़ेज़ (चित्रा 1 बी, सी) में अलग कर देगी। अर्धसूत्रीविभाजन (चित्रा 1 बी) और माइटोसिस (चित्रा 1 सी) दोनों में स्पिंडल रूपों, कई अतिव्यापी सूक्ष्मनलिकाएं धागे की तरह केंद्रीय अक्ष के चारों ओर लिपटे नहीं बल्कि इंटरफ़ेस के समानांतर चल रहे हैं। इन सूक्ष्मनलिका-आधारित संरचनाओं को बनाने के लिए संबंधित प्रोटीन की आवश्यकता होती है जो क्रॉसलिंक और संबंधित एंजाइम जो गुणसूत्रों को धक्का देने और खींचने में मदद करने के लिए मोटर्स के रूप में कार्य कर सकते हैं1.
अर्धसूत्रीविभाजन स्पिंडल के अध्ययन से पता चला है कि सूक्ष्मनलिकाएं क्रॉसलिंक्ड सरणियों 2,3,4,5,6 (चित्रा 1डीआई) में छोटी, गतिशील और अतिव्यापी हैं। इन छोटे सूक्ष्मनलिकाएं के भौतिक संगठन के कारण, अर्धसूत्रीविभाजन धुरी एक तरल क्रिस्टल टैक्टोइड (चित्रा 1 ई) के समान है। दरअसल, स्पिंडल को एकजुट करने और विलय करने के लिए दिखाया गया है, जैसा कि कोई तरल क्रिस्टलटैक्टोइड्स 5 से उम्मीद करेगा।
1960 के दशक में वापस डेटिंग करने वाले कई अध्ययनों ने निर्धारण, धारावाहिक वर्गों और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग यह निर्धारित करने के लिए किया है कि माइटोटिकस्पिंडल 7,8,9,10 के अंदर दो प्रकार के सूक्ष्मनलिकाएं हैं। पहले प्रकार को किनेटोकोर सूक्ष्मनलिकाएं कहा जाता है, जो स्पिंडल ध्रुव को कीनेटोकोर से जोड़ता है। दूसरे प्रकार को इंटरपोलर या ध्रुवीय सूक्ष्मनलिकाएं कहा जाता है, जो गुणसूत्रों से आगे बढ़ते हैं और मिडज़ोन (चित्रा 1 डीआईआई) 8,9,10 पर ओवरलैप होते हैं। एक तीसरे प्रकार को सूक्ष्म सूक्ष्मनलिकाएं कहा जाता है, जो धुरी के बाहर होते हैं और ध्रुवों को सेल किनारे से जोड़ते हैं; ये सूक्ष्मनलिका संगठन वर्तमान चर्चा के दायरे से बाहर हैं। सूक्ष्मनलिकाएं के लिए न्यूक्लिएशन केंद्रों को प्रभावित करने वाले ऑगमिन6 और गामा-ट्यूबुलिन रिंग कॉम्प्लेक्स के बीच बातचीत पर हालिया अध्ययन हुए हैं, जिसके परिणामस्वरूप चित्रा 1 डी की तरह छोटे सूक्ष्मनलिकाएं के साथ एक माइटोटिक स्पिंडल होता है।
चूंकि सूक्ष्मनलिकाएं चौड़ी होने की तुलना में लंबी होती हैं, उच्च पहलू अनुपात और उच्च कठोरता के साथ, वे तरल क्रिस्टल अणुओं के स्केल-अप संस्करणों की तरह होते हैं। नरम पदार्थ भौतिकी में, परमाणुओं और अणुओं को न्यूक्लिएशन और क्रिस्टल के पिघलने सहित चरण संक्रमण के भौतिक तंत्र को कम करने के लिए न्यूनतम इंटरैक्शन का उपयोग करके अनुमानित किया गया है11. इसी तरह, सूक्ष्मनलिकाएं मेसोस्केल ऑब्जेक्ट्स हैं जो लिक्विड क्रिस्टल अणुओं के स्केल-अप संस्करण हैं, जो लिक्विड क्रिस्टल गतिशीलता के भौतिकी में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं, जिसमें आइसोट्रोपिक लोगों से नेमेटिक चरणों के न्यूक्लिएशन और विकास शामिल हैं। इसके अलावा, जैसा कि ऊपर चर्चा की गई है, अर्धसूत्रीविभाजन धुरी एक तरल क्रिस्टल टैक्टोइड जैसे गुणों को प्रदर्शित करती है, एक नेमेटिक अवस्था जो तरल क्रिस्टल अणुओं 3,4,5 के आइसोट्रोपिक राज्य से न्यूक्लिएट और बढ़ती है। टैक्टोइड्स के लिए, न्यूक्लिएशन और विकास अन्य क्रिस्टल की तरह होते हैं (यानी, मेसोजेन की अपेक्षाकृत उच्च सांद्रता की आवश्यकता होती है [अणु जो तरल क्रिस्टल बनाते हैं])। टैक्टॉइड का अद्वितीय “स्पिंडल” आकार तरल क्रिस्टल मेसोजेन के स्थानीय संरेखण से आता है जो नेमेटिक चरण (चित्रा 1 ई) में संरेखित होता है। वे एक गोल क्रिस्टल नहीं बना सकते क्योंकि अणु अत्यधिक असममित होते हैं। सूक्ष्मनलिकाएं की प्रकृति को देखते हुए, यह शायद आश्चर्य की बात नहीं है कि सूक्ष्मनलिकाएं की उच्च स्थानीय एकाग्रता से बनी माइटोटिक स्पिंडल-मशीनरी भी उसी आकार की है, चाहे उसे टैक्टोइड या स्पिंडल कहा जाता हो। टैक्टोइड द्विध्रुवी हो सकते हैं, पतला सिरों पर ध्रुवों के साथ (चित्रा 1 ईआई), या सजातीय, अनंत (चित्रा 1ईआईआई) पर प्रभावी ढंग से ध्रुवों के साथ।
स्पिंडल गठन के महत्व को देखते हुए, आयनिक प्रजातियों12,13 के माध्यम से बंडलों में सूक्ष्मनलिका संक्षेपण का प्रदर्शन करके कृत्रिम परिवेशीय में स्व-संगठित स्पिंडल गठन की दिशा में प्रयास चल रहे हैं, भीड़ एजेंट जो कमी इंटरैक्शन14,15 बनाते हैं, और विशिष्ट सूक्ष्मनलिकाएं क्रॉसलिंकिंग प्रोटीन 13,16,17,18,19, 21. हैरानी की बात है, हालांकि ये एजेंट सूक्ष्मनलिकाएं की स्थानीय एकाग्रता को बढ़ाने के लिए काम करते हैं, वे अक्सर लंबे सूक्ष्मनलिकाएं बंडलों का परिणाम देते हैं लेकिन टैक्टोइड नहीं। इन बंडलों के लंबे होने का एक कारण यह हो सकता है कि इनमें शामिल सूक्ष्मनलिकाएं भी लंबी होती हैं। छोटे सूक्ष्मनलिकाएं का उपयोग करके हाल के काम ने लंबे बंडलों की भी सूचना दी जो अंतमें पतला नहीं हैं 15; इस मामले में, बंडलों को मोटर प्रोटीन के साथ एक साथ रखा जाता है जो बंडलों के विस्तार का कारण बनता है और इस तरह, उन्हें लंबा बनाता है। गैर-एक्सटेंसाइल क्रॉसलिंकर के साथ लघु सूक्ष्मनलिकाएं पतला, धुरी जैसी असेंबली के लिए आवश्यक हैं, जैसा कि यहां वर्णित है।
हाल ही में, हमने स्थिर सूक्ष्मनलिकाएं22 की उपस्थिति में एंटीपैरेलल क्रॉसलिंकर, एमएपी 65 का उपयोग करके सूक्ष्मनलिकाएं टैक्टोइड्स के निर्माण को सक्षम करने के लिए एक तकनीक विकसित की है। सूक्ष्मनलिकाएं छोटी होनी चाहिए, फिर भी सूक्ष्मनलिकाएं लंबाई के कुछ ज्ञात नियामक गतिशील अस्थिरता या एंड-टू-एंड एनीलिंग के खिलाफ सूक्ष्मनलिकाएं कैप कर सकते हैं। इसके बजाय, जीएमपीसीपीपी का उपयोग विकास के बाद फिलामेंट्स को न्यूक्लिएट और स्थिर करने के लिए किया गया था। इसने लघु सूक्ष्मनलिकाएं का एक उच्च घनत्व बनाने की अनुमति दी जो टैक्टोइड्स में स्व-व्यवस्थित हो सकते थे। बिरेफ्रिंजेंस के तहत देखे जाने पर ये टैक्टोइड सजातीय थे। लघु सूक्ष्मनलिकाएं के अलावा, एक विशिष्ट एंटीपैरेलल क्रॉसलिंकर, एमएपी 65, को टैक्टोइड्स (चित्रा 2) बनाने के लिए नियोजित किया गया था। एमएपी 65 माइटोटिक क्रॉसलिंकर्स23 के पीआरसी 1 / एएसई 1 परिवार में एक पौधे सूक्ष्मनलिका से जुड़ा प्रोटीन है। एमएपी 65 एक डिमर के रूप में मौजूद है, जिसमें खुद के साथ-साथ सूक्ष्मनलिकाएं24 को बांधने के लिए एक मजबूत आत्मीयता है। एक्टिन फिलामेंट्स25,26,27 के साथ देखे गए अर्धसूत्रीविभाजन स्पिंडल और टैक्टोइड्स के विपरीत, जो द्विध्रुवी हैं और तरल क्रिस्टल के तरल जैसे गुण हैं, सूक्ष्मनलिकाएं टैक्टोइड्स को ठोस जैसे22,28 देखा गया है।
यहां, प्रोटोकॉल सूक्ष्मनलिकाएं टैक्टोइड बनाने और असेंबली के आकार और प्रतिदीप्ति-आधारित तकनीकों का उपयोग करके घटकों की गतिशीलता की विशेषता के लिए प्रस्तुत किए जाते हैं।
यहां वर्णित विधियों का उपयोग सूक्ष्मनलिकाएं टैक्टोइड्स (चित्रा 2)22,28 बनाने के लिए कई पत्रों में किया गया है। ये प्रयोग संगठनात्मक सिद्धांतों को उजागर करने में मदद करने के लिए जैविक रूप से प्रासंगिक हैं जो अधिकांश सेल प्रकारों में माइटोटिक या अर्धसूत्रीविभाजन स्पिंडल के आकार और स्थिरता को नियंत्रित करते हैं। इसके अलावा, सूक्ष्मनलिकाएं मॉडल लिक्विड क्रिस्टल मेसोजेन हैं जो इस बारे में अधिक जानने में मदद कर सकती हैं कि लिक्विड क्रिस्टल आइसोट्रोपिक चरणों से नेमैटिक चरणों को कैसे न्यूक्लिएट और विकसित करते हैं।
यहां उल्लिखित प्रक्रिया में सूक्ष्मनलिका स्व-संगठन की खोज के लिए कई फायदे हैं। सबसे पहले, यह अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है, प्रयोगशाला में शुरू होने से पहले बहुत कम पूर्वज्ञान या प्रशिक्षण के साथ हाई स्कूल के छात्रों सहित कई छात्रों द्वारा प्रयोगशाला में प्रदर्शन किया गया है। टैक्टोइड्स बिरेफ्रिंजेंट22 हैं, जिससे उन्हें प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के अलावा प्रेषित प्रकाश में देखा जा सकता है, जिससे यह विधि कई प्रयोगशालाओं के लिए सुलभ हो जाती है और यह प्रयोगात्मक प्रक्रिया उच्च अंत अनुसंधान के अलावा शैक्षिक उद्देश्यों के अनुकूल होती है। अंत में, यह प्रक्रिया एक छीन-डाउन, न्यूनीकरणवादी दृष्टिकोण में जैविक प्रणालियों को समझने और जांच करने के लिए रास्ते खोलती है, जिससे कोई यह समझने की अनुमति देता है कि प्रत्येक अतिरिक्त स्थिति, प्रोटीन या योजक टैक्टोइड्स के आत्म-संगठन को कैसे बदल सकता है और, शायद, अंततः, स्पिंडल। बेहतर बायोमिमिक्री के लक्ष्यों में गतिविधि, तरलता और फिलामेंट ध्रुवीयता छंटाई शामिल हैं।
अप्रत्याशित परिणाम देने वाले प्रयोग को प्रभावित करने वाले कई कारक हो सकते हैं। उदाहरण के लिए, यदि टैक्टोइड्स नहीं बनते हैं (चित्रा 2) लेकिन प्रशंसक जैसे पैटर्न देखे जाते हैं, तो एमएपी 65 संभवतः सूक्ष्मनलिकाएं22,28 के लिए मौजूद नहीं है या बाध्यकारी नहीं है। यह एमएपी 65 प्रतिदीप्ति चैनल में भी स्पष्ट होना चाहिए क्योंकि जीएफपी-एमएपी 65 सूक्ष्मनलिकाएं से बंधा नहीं होगा।
यदि टैक्टोइड नहीं बनते हैं और पृष्ठभूमि कांच पर धब्बे के रूप में दिखाई देती है, तो यह सतह कोटिंग के कारण हो सकता है। एक बार प्रदर्शन करने के बाद, सिलेनाइजेशन कवरलिप्स पर केवल 1 महीने तक रहता है। जब यह पहनता है, तो ट्यूबुलिन उजागर सतह को गैर-विशेष रूप से बांधने में सक्षम होगा। यह बाध्यकारी विषम पैटर्न में होगी।
यदि टैक्टोइड नहीं बनते हैं और ट्यूबुलिन को विभिन्न आकृतियों और आकारों के समुच्चय में देखा जाता है, तो यह खराब गुणवत्ता वाले ट्यूबुलिन के कारण हो सकता है। ट्यूबुलिन को प्रारंभिक समुच्चय को हटाने के लिए सेंट्रीफ्यूज किया जा सकता है जो सूक्ष्मनलिका पोलीमराइजेशन के बजाय इस ऑफ-पाथवे एकत्रीकरण को चला सकता है। यदि सतह ट्यूबुलिन के लिए बाध्यकारी है, तो यह समाधान में ट्यूबुलिन को भी कम कर सकती है। ट्यूबुलिन की कम सांद्रता, सूक्ष्मनलिकाएं पोलीमराइज़ करने के लिए महत्वपूर्ण एकाग्रता के नीचे, समुच्चय में परिणाम कर सकते हैं।
एफआरएपी प्रयोगों में, यदि एमएपी 65 चैनल किसी भी वसूली (चित्रा 5) को नहीं दिखाता है, तो यह संभव है कि फोटोब्लीचिंग सूक्ष्मनलिकाएं फोटोडैमिंग कर रही थी। फोटोडैमेज फिलामेंट्स के स्थानीयकृत विनाश का कारण बनता है। प्रेषित चैनल में परीक्षा द्वारा इसकी जाँच की जा सकती है। सूक्ष्मनलिकाएं टैक्टोइड आसपास के पानी के साथ अपवर्तन बेमेल के उच्च सूचकांक के माध्यम से प्रेषित चैनल में दिखाई देते हैं। प्रकाश-प्रेरित फोटोडैमेज फोटोब्लीचिंग के अधीन आरओआई के स्थान पर प्रेषित प्रकाश इमेजिंग में जलने के निशान या इसके विपरीत नुकसान के रूप में दिखाई देगा। यदि ऐसा होता है, तो प्रोटीन के फोटोडैमेज को बाधित करने के लिए लेजर या प्रकाश शक्ति को कम किया जाना चाहिए।
इस प्रक्रिया और दृष्टिकोण में कई चुनौतियों का सामना करना पड़ा। एक मुद्दा यह है कि लंबाई के उपाय वर्तमान में छवि पर क्लिक करके हाथ से किए जाते हैं। यह विधि, जबकि सीधी है, उच्च अनिश्चितता में परिणाम कर सकते हैं। चौड़ाई माप जो क्रॉस-सेक्शन का उपयोग करता है और गाऊसी के लिए फिटिंग आकार को मापने के लिए एक बेहतर तरीका है। लंबाई के लिए एक समान विधि नियोजित की जा सकती है। एक दूसरा मुद्दा यह है कि, कभी-कभी, टैक्टोइड्स, क्योंकि वे इतने लंबे और पतले होते हैं, झुक सकते हैं। इससे लंबाई को निर्धारित करना अधिक कठिन हो जाता है। समोच्च लंबाई को खंडित रेखा का उपयोग करके परिमाणित किया जा सकता है, लेकिन हर बार एक खंड जोड़े जाने पर अतिरिक्त अनिश्चितता होती है।
वैज्ञानिक दृष्टिकोण से, इस दृष्टिकोण में तरल क्रिस्टल या स्पिंडल के लिए एक मॉडल के रूप में इसके उपयोग के लिए कुछ अन्य चुनौतियां हैं। पहली चुनौती टैक्टोइड्स का लंबा, पतला आकार रहा है जो सूक्ष्मनलिकाएं बनाते हैं (चित्रा 3 और चित्रा 4)। जैसा कि पूर्व प्रकाशनों22 में उल्लेख किया गया है, सूक्ष्मनलिकाएं टैक्टोइड सजातीय टैक्टोइड हैं, द्विध्रुवी नहीं। इसका मतलब यह है कि आकृति बनाने वाले सूक्ष्मनलिकाएं संरचना की युक्तियों की ओर इशारा करने के लिए पुन: उन्मुख नहीं होती हैं। इसके बजाय, सभी सूक्ष्मनलिकाएं लंबी धुरी के समानांतर हैं और “ध्रुव” अनंत पर स्थित हैं। यह आणविक तरल क्रिस्टल या यहां तक कि एक्टिन या डीएनए के लिए देखे गए टैक्टोइड्स से बहुत अलग है जो तरल क्रिस्टल मेसोजेन के रूप में भी कार्य कर सकते हैं। इन अन्य प्रणालियों में, टैक्टोइड द्विध्रुवी होते हैं और, जब पार किए गए ध्रुवीकरण में देखा जाता है, तो वे छड़ के पुन: अभिविन्यास के गप्पी संकेत दिखाते हैं।
इस प्रणाली में एक दूसरी बड़ी चुनौती यह है कि सूक्ष्मनलिकाएं टैक्टोइड के अंदर स्थिर होती हैं। यह एफआरएपी प्रयोगों और विश्लेषण से स्पष्ट है क्योंकि सूक्ष्मनलिकाएं की वसूली बहुत कम है। उनकी ठोस जैसी प्रकृति सूक्ष्मनलिकाएं टैक्टोइड्स को बड़े पैमाने पर तरल क्रिस्टल एनालॉग्स के रूप में कम मूल्यवान बनाती है। एक तरल क्रिस्टल के नेमेटिक चरण में तरल (द्रव) और क्रिस्टल (संगठित) दोनों गुण होने चाहिए। यद्यपि आकार धुरी के लिए सही लगता है, गतिहीनता सिस्टम को मॉडल माइटोटिक स्पिंडल के रूप में कम रोमांचक बनाती है। दूसरी ओर, यह मुद्दा यह जांचने के अवसर प्रदान करता है कि सिस्टम में अधिक तरलता बनाने के लिए प्रयोगों को कैसे संशोधित किया जा सकता है।
ये वैज्ञानिक चुनौतियां रोमांचक अवसर प्रदान करती हैं जो सिस्टम के बारे में नए ज्ञान की अनुमति देंगी। सूक्ष्मनलिकाएं टैक्टोइड्स को अधिक द्विध्रुवी बनाने के लिए, कोई भी छोटे सूक्ष्मनलिकाएं का उपयोग कर सकता है। हालांकि, एक अतिरिक्त चुनौती है, क्योंकि सूक्ष्मनलिकाएं में एक्टिन के रूप में लंबाई को नियंत्रित करने के लिए कई अच्छी तरह से विशेषता कैपिंग प्रोटीन नहीं होते हैं। न्यूक्लिएशन और विकास के उपयोग के लिए छोटे सूक्ष्मनलिकाएं बनाने के लिए ट्यूबुलिन और जीएमपीसीपीपी की बहुत अधिक सांद्रता के उपयोग की आवश्यकता होती है। उच्च ट्यूबुलिन एकाग्रता के परिणामस्वरूप सिस्टम में बड़ी संख्या में फिलामेंट्स होते हैं, जिससे एक दूसरे से टैक्टोइड को अलग करना अधिक कठिन हो जाता है। नए सूक्ष्मनलिका कैपर, जैसे कि डारपिन33 के अलावा, इस स्थिति में मदद मिल सकती है। सूक्ष्मनलिकाएं स्थिर होने के दूसरे मुद्दे को मोटर प्रोटीन के अलावा कम किया जा सकता है, जैसे कि किनेसिन -534, जो माइटोसिस में उपयोग किए जाने वाले मोटर्स के टेट्रामर हैं। वैकल्पिक रूप से, डिमेरिक किन्सिन -1 के कृत्रिम डिमर्स का उपयोग15 किया जा सकता है।
अधिक तरलता जोड़ने का एक और तरीका सूक्ष्मनलिकाएं अपनी गतिशील अस्थिरता, सूक्ष्मनलिकाएं के बढ़ने और सिकुड़ने की अनुमति देना होगा। वर्तमान में, सूक्ष्मनलिकाएं जो स्थिर जीएमपीसीपीपी फिलामेंट्स के साथ वरीयता प्राप्त होती हैं और फिर गतिशील अस्थिरता से गुजरती हैं, एक स्पिंडल या टैक्टॉइड बनाने के लिए वांछित से कहीं अधिक लंबी होती हैं, जिसके परिणामस्वरूप प्रशंसकों या बंडलों जैसे बहुत लंबे संगठन होंगे। इसलिए, सूक्ष्मनलिका गतिशील अस्थिरता को जोड़ने के लिए टैक्टोइड आकार को संरक्षित करने के लिए सावधानीपूर्वक किया जाना चाहिए। संबंधित प्रोटीन और एंजाइमों के अलावा जो लंबाई को नियंत्रित कर सकते हैं, इस मुद्दे को कम कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, किन्सिन -1335 जैसे किनेसिन को डीपॉलिमराइज करना, या कटानिन36 जैसे अलग-अलग एंजाइमों की आवश्यकता होगी। ये प्रयोग जटिल और कठिन हैं, हालांकि वे बहुत व्यावहारिक होंगे, इससे कोई फर्क नहीं पड़ता कि परिणाम क्या प्रकट करते हैं। भविष्य के प्रयोग जो भी दिशा लेते हैं, सूक्ष्मनलिकाएं बनाने के लिए यहां विकसित मंच सूक्ष्मनलिका संगठन के भौतिक आधार पर नई जानकारी का पर्दाफाश कर सकता है।
The authors have nothing to disclose.
लेखक सभी ग्रीष्मकालीन 2021 रॉस लैब सदस्यों, विशेष रूप से के एलिस लिंडसे को उनकी मदद के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं। इस काम को एनएसएफ बीआईओ -2134215 के अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था जिसने एस साहू, एन गुडबी, एचबी ली और जेएल रॉस का समर्थन किया था। केईसीके फाउंडेशन (राय एंडरसन, यूएसडी, लीड पीआई) से अनुदान आंशिक रूप से समर्थित आर शाखा और पी चौहान
2% Dichlorodimethylsilane | GE Healthcare | 118945 | A hydrophobic silane surface treatment. This can be resused upto three times and kept at room temperature for one year. |
5-minute epoxy | Bob Smith Industries | For sealing experimental chambers | |
Acetone | Fisher | 32900HPLC | 100% |
BL21 cells | Bio Labs | C2527I | Competent bacterial cells used to express MAP65 |
Catalase | Sigma | C30-500MG | Part of the oxygen scavenging system. A 300 mg/ml stock is made in ddH2O and stored in 10 μl aliquots in -20°C for upto one year. |
Coverslips (22 mm x 22 mm or 22 mm x 30 mm) | Fisher | 12544-AP | For experimental chambers |
Dithiothreitol | Sigma | 43815-5G | A small molecule that is used to break disulfide bonds and scavenge oxygen. A 1 M stock is made from powder (Sigma) in ddH2O. The solution is aliquoted and stored at -20C for upto one year. The aliquots are used 7-8 times then discarded. |
EGTA | Sigma | E3889-10G | Tubulin buffer base ingredient |
Eppendorf 0.5 ml tubes | Eppendorf | 05 402 18 | For holding experimental solutions |
Ethanol | Fisher | 111000200 | 200 proof |
Filter paper | Whatman | 1004-110 | For cleaning and for pulling solutions through experimental chambers |
Fluorescence microscope with high NA objectives | Nikon | Ti-E, W2 Confocal | For imaging experiments |
Freezer -20°C | Fisherbrand | 13986148 | For storing reagents |
Freezer -80°C | Thermo scientific | 328223H01-C | For storing proteins. |
Glass containers for silanization | Michaels | For preparing experimental chambers – treating cover glasses | |
Glass slides | Fisher | 12544-4 | For experimental chambers |
Glucose | Sigma | G7528-250G | Part of the oxygen scavenging system. A 300 mg/ml stock is made in ddH2O and stored in 10 μl aliquots in -20°C. |
Glucose oxidase | Sigma | G2133-250KU | Part of the oxygen scavenging system. This is stored at 4°C for upto one year. |
GMPCPP | Jenna Bioscience | NU-4055 | Slowly hydrolyzable analog of GTP used to polymerize and stabilize the microtubules by reducing the dynamic instability and spontaneous critical concentration for microtubule nucleation to get a consistent length. We purchase a 10 mM stock from Jena Biosciences and store it at -20°C for upto one year. |
Heating element for microscope | Okolab stage top incubator | For imaging experiments | |
Imidizole | Sigma | I2399 | Used to elute MAP65 protein from Nickel beads to purify MAP65 |
Kimwipes | Fisher | 34155 | For cleaning and for pulling solutions through experimental chambers. |
KOH | Sigma | P250-500 | 1 M in ddH2O, made fresh to prevent acidification over time. |
Liquid Nitrogen | Airgas | NI 230LT22 | To drop freeze aliquots. This can also be used for storage (not recommended) |
MAP65 protein | Ram Dixit | A microtubule-associated protein (MAP) with a molecular weight of 65 kD that is an antiparallel microtubule crosslinker. We have purified an unlabeled and GFP-labeled version of MAP65-1 from Arabidopsis thaliana. We mix the GFP-MAP65 with the unlabeled MAP65 such that 10% of the protein is labeled. The working stock is a 10.8 μM solution. This working solution is stored at 4°C and remade fresh every week. The protocol for purifying the MAP65 and GFP-MAP65 is given in our prior methods chapter (26). | |
MgSO4 | Sigma | MKCJ940 | Tubulin buffer ingredient |
NTA-Nickel beads | Qiagen | 30210 | Beads required to purify 6xHis tagged MAP65 proteins |
Optomicroscan | Nikon | 405 nm laser system which can focus the laser in any desired shape of region of interest | |
PEM80 | Neutral tubulin polymerizing base buffer for solution made from 80 mM K-PIPES, pH 6.8, 1 mM MgSO4, 1 mM EGTA, stored at 4°C for upto one year. | ||
Permanent double-sided tape | 3M – Scotch | 34-8724-5691-7 | For experimental chambers |
Petri dish | Fisher | FB0875713 | For humid chamber |
PIPES | Sigma | P7643-100G | Tubulin buffer base ingredient |
Pluronic-F127 | Sigma | P2443-250G | A block-copolymer with two hydrophilic polyethylene oxide (PEO) blocks on the ends and a hydrophobic center block of polyphenylene oxide (PPO) hydrophobic surface coating we use to prevent protein binding to the surface. Pluronic-F127 is purchased as a powder (Sigma) and dissolved to a 5% (w/v) solution in ddH2O overnight. Once dissolved, the solution can be stored at room temperature for upto one year. |
Polyethylene Glycol | Affymetrix Inc | 19966 500 GM | A crowding agent used to create depletion forces to bring tactoids to the surface and help to organize microtubules. We create a 5% (w/v) solution of 100 kDa PEG in PEM80. The solution is stored in 4°C for upto one year and placed on the rocker before use. It is viscous, so we recommend using a positive displacement pipette to work with it. |
Positive displacement pipette | Eppendorf | For pipetting viscous liquids | |
Racks for coverslips | Electron Microscopy Sciences | 72240 | For preparing experimental chambers – treating cover glasses |
Refrigerator 4°C | Fisherbrand | For storing reagents | |
Tubulin Labeled | Cytoskeleton | TL590M | lyophilized rhodamine-labeled tubulin from pig brain is purchased (Cytoskeleton) and stored in -80°C until hydrated in PEM80 and used for upto one year. |
Tubulin protein | Cytoskeleton | T240 | lyophilized tubulin 99% pure unlabeled from pig brain is purchased (Cytoskeleton) and stored in -80°C until hydrated in PEM80 and used for upto one year. |
UV-Ozone | Jelight | Model 342 | For preparing experimental chambers – treating cover glasses |
Stackreg | Biomedical Imaging Group | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/ | plugin for registering time series data to remove drift |
Turboreg | Biomedical Imaging Group | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ | plugin for registering time series data to remove drift |