הרכבה עצמית של טקטואידים מיקרוטובולים
Summary
מאמר זה מציג פרוטוקול להיווצרות מכלולים של מיקרוטובולים בצורת טקטואידים תוך שימוש ב-MAP65, קרוסלינקר מיקרוטובולים על בסיס צמחי, ו-PEG כסוכן צפיפות.
Abstract
השלד הציטוסקלטון אחראי על הארגון הפנימי העיקרי ועל הארגון מחדש בתוך התא, כל זאת ללא מנהל שינהל את השינויים. זה במיוחד המקרה במהלך מיטוזה או meiosis, שבו microtubules ליצור את הציר במהלך חלוקת התא. הציר הוא המנגנון המשמש להפרדת חומר גנטי במהלך חלוקת התאים. לקראת יצירת צירים המאורגנים בעצמם במבחנה, פיתחנו לאחרונה טכניקה לשילוב מחדש של מיקרו-טובולים למכלולים דמויי ציר עם קבוצה מינימלית של חלבונים הקשורים למיקרוטובולים וסוכני צפיפות. באופן ספציפי, נעשה שימוש ב- MAP65, שהוא קרוסלינקר מיקרוטובול אנטי-פאראלי מצמחים, הומולוג של Ase1 משמרים ו- PRC1 מאורגניזמים יונקים. לינקר צולב זה מארגן בעצמו מיקרו-טובולים לתוך מכלולים ארוכים, דקים, דמויי צירים, המאורגנים בעצמם. מכלולים אלה דומים גם לטקטואידים של גבישים נוזליים, ומיקרוטובולים יכולים לשמש כמזוגנים מזוקליים. כאן מוצגים פרוטוקולים ליצירת טקטואידים מיקרוטובולים אלה, כמו גם לאפיון צורת המכלולים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית וניידות המרכיבים באמצעות התאוששות פלואורסצנטית לאחר הפוטו-הלבנה.
Introduction
חלוקת תאים באמצעות מיטוזה היא אחד התהליכים הביולוגיים החשובים ביותר לקיום חיים. חוטי המיקרוטובול, המורכבים מדימרים של טובולין, הם מרכיבים מבניים חיוניים של תהליך זה. המנגנון הארעי שנוצר במטפאזה כאשר הכרומוזומים מתיישרים במרכז התא נקרא הציר המיטוטי בשל צורתו, שהוא כמו ציר של נול המכוסה בחוטים (איור 1A). באורגניזמים רבים מבוסס היטב שמיקרוטובולים משמשים במטפאז כדי לדחוף ולמשוך כרומוזומים מרוכזים למרכז התא, ליישר אותם ולחבר אותם למיקרוטובולים שימשכו אותם זה מזה באנאפאזה (איור 1B,C). צורות הציר הן במיוזה (איור 1B) והן במיטוזה (איור 1C), שנוצרו ממיקרוטובולים חופפים רבים שאינם עטופים סביב הציר המרכזי כמו חוט אלא פועלים במקביל לממשק. יצירת מבנים מבוססי מיקרו-טובולים אלה דורשת חלבונים קשורים המקשרים קשרים זה לזה ואנזימים נלווים שיכולים לשמש כמנועים כדי לעזור לדחוף ולמשוך את הכרומוזומים1.
מחקרים על צירים מיוטיים הראו שהמיקרוטובולים קצרים, דינמיים וחופפים במערכים מקושרים 2,3,4,5,6 (איור 1Di). בשל הארגון הפיזי של המיקרוטובולים הקצרים האלה, הציר המיוטי דומה לטקטואיד גבישי נוזלי (איור 1E). ואכן, הודגם כי צירים מתלכדים ומתמזגים, כפי שניתן היה לצפות מטקטואידים של גבישים נוזליים5.
מחקרים רבים שראשיתם בשנות ה-60 של המאה ה-20 השתמשו בקיבוע, בקטעים סדרתיים ובמיקרוסקופיית אלקטרונים כדי לקבוע כי ישנם שני סוגים של מיקרוטובולים בתוך הציר המיטוטי 7,8,9,10. הסוג הראשון נקרא מיקרוטובולים קינטוצ’ור, המחברים את מוט הציר לקינטוכור. הסוג השני נקרא מיקרו-טובולים אינטר-קוטביים או קוטביים, שגדלים מעבר לכרומוזומים וחופפים באזור האמצע (איור 1Dii)8,9,10. סוג שלישי נקרא מיקרוטובולים אסטרליים, שנמצאים מחוץ לציר ומחברים את הקטבים לקצה התא; ארגונים מיקרו-טובים אלה נמצאים מחוץ לתחום הדיון הנוכחי. לאחרונה נערכו מחקרים על האינטראקציה בין אוגמין6 לבין קומפלקס טבעות גמא-טובולין המשפיעים על מרכזי נוקלאציה של מיקרוטובולים, וכתוצאה מכך נוצר ציר מיטוטי עם מיקרוטובולים קצרים יותר כמו באיור 1D.
מאחר שמיקרו-טובולים ארוכים יותר מכפי שהם רחבים, עם יחס גובה-רוחב גבוה ונוקשות גבוהה, הם דומים לגרסאות מוגדלות של מולקולות גביש נוזלי. בפיזיקה של חומר רך, אטומים ומולקולות הוערכו באמצעות אינטראקציות מינימליות כדי להסיק את המנגנונים הפיזיקליים של מעברי פאזה, כולל נוקלאציה והמסת גבישים11. באופן דומה, מיקרוטובולים הם עצמים מזוקליים שהם גרסאות מוגדלות של מולקולות גבישיות נוזליות, מה שנותן תובנות על הפיזיקה של הדינמיקה של גבישים נוזליים, כולל נוקלאציה וצמיחה של הפאזות הנמטיות מאלו האיזוטרופיות. יתר על כן, כפי שפורט לעיל, הציר המיוטי מציג תכונות כמו אלה של טקטואיד גבישי נוזלי, מצב נמאטי שנובע וצומח מהמצב האיזוטרופי של מולקולות גבישיות נוזליות 3,4,5. עבור טקטואידים, נוקלאציה וצמיחה הם כמו של גבישים אחרים (כלומר, דורשים ריכוז גבוה יחסית של מזוגנים [המולקולות היוצרות גבישים נוזליים]). צורת ה”ציר” הייחודית של הטקטואיד מגיעה מהיישור המקומי של מזוגני הגביש הנוזלי שמתיישרים לפאזה הנמטית (איור 1E). הם אינם יכולים ליצור גביש מעוגל מכיוון שהמולקולות הן מאוד אסימטריות. בהתחשב באופיים של המיקרוטובולים, זה אולי לא מפתיע שמכונות הציר המיטוטיות העשויות מריכוז מקומי גבוה של מיקרוטובולים הן גם בעלות אותה צורה, בין אם הן נקראות טקטואיד או ציר. טקטואידים יכולים להיות דו-קוטביים, עם קטבים בקצוות המחודדים (איור 1Ei), או הומוגניים, עם קטבים ביעילות באינסוף (איור 1Eii).
בהתחשב בחשיבות של היווצרות צירים, נעשו מאמצים לקראת היווצרות צירים מאורגנת עצמית במבחנה על ידי הדגמת עיבוי מיקרוטובולים לתוך צרורות באמצעות מינים יוניים12,13, סוכני צפיפות היוצרים אינטראקציות דלדול14,15, וחלבוני קישור צולבים ספציפיים של מיקרוטובולים 13,16,17,18,19, 21. באופן מפתיע, למרות שסוכנים אלה כולם פועלים כדי להגדיל את הריכוז המקומי של מיקרוטובולים, לעתים קרובות הם גורמים לחבילות מיקרוטובולים ארוכים אך לא לטקטואידים. אחת הסיבות לכך שצרורות אלה ארוכים יכולה להיות שגם המיקרוטובולים המרכיבים אותם ארוכים. עבודות אחרונות באמצעות מיקרוטובולים קצרים יותר דיווחו גם על צרורות ארוכים יותר שאינם מחודדים בסוף15; במקרה זה, הצרורות מוחזקים יחד עם חלבונים מוטוריים הגורמים להרחבה של הצרורות, ובכך הופכים אותם לארוכים יותר. מיקרוטובולים קצרים עם קרוסלינקרים שאינם מורחבים נחוצים למכלולים מחודדים דמויי ציר, כפי שמתואר כאן.
לאחרונה, פיתחנו טכניקה המאפשרת יצירת טקטואידים של מיקרוטובולים באמצעות ה-crosslinker האנטי-פאראלי, MAP65, בנוכחות מיקרו-טובולים יציבים22. המיקרוטובולים היו צריכים להיות קצרים, אך מעטים הרגולטורים הידועים באורך המיקרוטובולים שיכולים להכביד על מיקרוטובולים מפני חוסר יציבות דינמית או חישול מקצה לקצה. במקום זאת, GMPCPP שימש לגרעין וייצוב החוטים לאחר הגדילה. זה איפשר ליצור צפיפות גבוהה של מיקרוטובולים קצרים שיכולים להתארגן בעצמם לטקטואידים. טקטואידים אלה היו הומוגניים כאשר צפו בהם תחת דו-פרצופיות. בנוסף למיקרו-טובולים קצרים, נעשה שימוש ב-crosslinker אנטי-פאראלי ספציפי, MAP65, כדי ליצור את הטקטואידים (איור 2). MAP65 הוא חלבון הקשור למיקרוטובולים צמחיים במשפחת ה-PRC1/Ase1 של קרוסלינקרים מיטוטיים23. MAP65 קיים כדימר, עם זיקה חזקה להיקשר לעצמו כמו גם למיקרוטובולים24. שלא כמו הציר המיוטי והטקואידים שנצפו עם חוטי אקטין 25,26,27, שהם דו קוטביים ובעלי תכונות דמויות נוזל של גבישים נוזליים, טקטואידים מיקרוטובולים נצפו כמוצקים כמו 22,28.
כאן, מוצגים פרוטוקולים ליצירת טקטואידים microtubule ואפיון צורת המכלולים ואת הניידות של המרכיבים באמצעות טכניקות מבוססות פלואורסצנציה.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטות המתוארות כאן שימשו בכמה מאמרים ליצירת טקטואידים של מיקרוטובולים (איור 2)22,28. ניסויים אלה רלוונטיים מבחינה ביולוגית כדי לסייע בחשיפת העקרונות הארגוניים השולטים בצורה וביציבות של הציר המיטוטי או המיוטי ברוב סוגי התאים. בנוסף, מיקרוטובולים הם מזוגנים של גבישים נוזליים לדוגמה שיכולים לסייע בלמידה נוספת על האופן שבו גבישים נוזליים מגרגרים ומגדלים פאזות נמטיות משלבים איזוטרופיים.
להליך המתואר כאן יש מספר יתרונות לחקר ארגון עצמי של מיקרוטובולים. ראשית, הוא ניתן לשחזור רב, לאחר שבוצע במעבדה על ידי תלמידים רבים, כולל תלמידי תיכון, עם מעט ידע או הכשרה לפני תחילתו במעבדה. הטקטואידים הם דו-פרצופיים22, מה שמאפשר לצפות בהם באור מועבר בנוסף למיקרוסקופיה פלואורסצנטית, מה שהופך את השיטה הזו לנגישה למעבדות רבות ולהליך הניסויי הזה הניתן להתאמה למטרות חינוכיות, בנוסף למחקר מתקדם. לבסוף, תהליך זה פותח אפיקים להמשיך להבין ולחקור מערכות ביולוגיות בגישה רדוקציוניסטית מופשטת, ומאפשר להבין כיצד כל מצב, חלבון או תוסף נוסף יכול לשנות את הארגון העצמי של הטקטואידים, ואולי, בסופו של דבר, את הציר. מטרות לביומימיקריה טובה יותר כוללות פעילות, נזילות ומיון קוטביות נימה.
יכולים להיות מספר גורמים המשפיעים על הניסוי ומעניקים תוצאות בלתי צפויות. לדוגמה, אם הטקטואידים אינם נוצרים (איור 2) אך נצפים דפוסים דמויי מניפה, סביר להניח שה-MAP65 אינו קיים או אינו נקשר למיקרו-טובולים22,28. זה צריך להיות ברור גם בערוץ הפלואורסצנטי MAP65 מכיוון שה-GFP-MAP65 לא יהיה קשור למיקרוטובולים.
אם הטקטואידים לא נוצרים והרקע מופיע ככתמים על הזכוכית, זה יכול להיות בגלל ציפוי פני השטח. לאחר ביצועו, הסילאניזציה נמשכת חודש אחד בלבד על כיסויים. כאשר הוא מתפוגג, הטובולין יוכל להיקשר למשטח החשוף באופן לא ספציפי. כריכה זו תתרחש בדפוסים מוזרים.
אם הטקטואידים אינם נוצרים והטובולין נצפה באגרגטים של צורות וגדלים שונים, זה יכול להיות בגלל טובולין באיכות ירודה. טובולין יכול להיות צנטריפוגה כדי להסיר אגרגטים ראשוניים שיכולים להניע את הצבירה הזו מחוץ למסלול במקום פילמור מיקרוטובולים. אם המשטח נקשר לטובולין, הוא יכול גם לרוקן את הטובולין בתמיסה. ריכוזים נמוכים של טובולין, מתחת לריכוז הקריטי לפולימריזציה של מיקרוטובולים, עלולים לגרום לאגרגטים.
בניסויי FRAP, אם ערוץ MAP65 אינו מראה התאוששות כלשהי (איור 5), ייתכן שהלבנת הצילום צילמה את המיקרו-טובולים. Photodamage גורם להרס מקומי של החוטים. ניתן לבדוק זאת על ידי בדיקה בערוץ המועבר. טקטואידים של מיקרוטובולים נראים בתעלה המועברת דרך אינדקס גבוה של אי התאמה של אי-התאמה לשבירה עם המים שמסביב. פוטו-דמה המושרה על-ידי אור יופיע כסימן צריבה או אובדן ניגודיות בהדמיית אור מועברת במיקום ההחזר על ההשקעה הנתונה להלבנת תמונות. אם זה קורה, יש להפחית את כוח הלייזר או האור כדי לעכב את הפוטו-דמה של החלבונים.
היו מספר אתגרים שנתקלו בהם בהליך ובגישה זו. בעיה אחת היא שמדדי האורך מבוצעים כעת ביד על ידי לחיצה על התמונה. שיטה זו, למרות שהיא פשוטה, עלולה לגרום לאי-ודאות גבוהה. מדידת הרוחב המשתמשת בחתך הרוחב ומתאימה לגאוס היא שיטה טובה יותר לכימות הגודל. ניתן להשתמש בשיטה דומה לאורך. בעיה שנייה היא שלפעמים, הטקטואידים, בגלל שהם כל כך ארוכים ודקים, יכולים להתכופף. זה הופך את כימות האורך לקשה יותר. ניתן לכמת את אורך קווי המתאר באמצעות קו מקוטע, אך יש אי-ודאות נוספת בכל פעם שמוסיפים מקטע.
מנקודת מבט מדעית, לגישה זו יש כמה אתגרים אחרים לשימוש בה כמודל לגבישים נוזליים או צירים. האתגר הראשון היה הצורה הארוכה והדקה של הטקטואידים שהמיקרוטובולים יוצרים (איור 3 ואיור 4). כפי שצוין בפרסומים קודמים22, טקטואידים מיקרוטובולים הם טקטואידים הומוגניים, לא דו קוטביים. משמעות הדבר היא שהמיקרוטובולים המרכיבים את הצורה אינם מכוונים מחדש כדי להצביע לעבר קצות המבנה. במקום זאת, כל המיקרוטובולים מקבילים לציר הארוך וה”קטבים” ממוקמים באינסוף. זה שונה מאוד מהטקטואידים שנצפו לגבישים נוזליים מולקולריים או אפילו לאקטין או דנ”א שיכולים לשמש גם כמזוזנים גבישיים נוזליים. במערכות אחרות אלה, הטקטואידים הם דו קוטביים, וכאשר מסתכלים עליהם בקטבים חצויים, הם מראים את הסימנים המובהקים של כיוון מחדש של המוטות.
אתגר מרכזי נוסף במערכת זו הוא שהמיקרוטובולים אינם משותקים בתוך הטקטואיד. זה ברור מניסויים וניתוחים של FRAP מכיוון שההתאוששות של המיקרוטובולים נמוכה מאוד. האופי המוצק שלהם הופך את הטקטואידים של המיקרוטובולים לפחות בעלי ערך כמו אנלוגים של גבישים נוזליים בקנה מידה גדול. הפאזה הנמטית של גביש נוזלי צריכה להיות בעלת תכונות נוזליות (נוזל) וקריסטליות (מאורגנות). למרות שהצורה נראית מתאימה לציר, חוסר התנועה הופך את המערכת לפחות מרגשת כציר מיטוטי מדגם. מצד שני, בעיה זו מספקת הזדמנויות לחקור כיצד ניתן לשנות את הניסויים כדי ליצור נזילות רבה יותר במערכת.
אתגרים מדעיים אלה מציעים הזדמנויות מרגשות שיאפשרו ידע חדש על המערכת. כדי להפוך את הטקטואידים המיקרו-טובולים לדו-קוטביים יותר, אפשר להשתמש במיקרו-טובולים קצרים יותר. עם זאת, יש אתגר נוסף, מכיוון שלמיקרוטובולים אין הרבה חלבוני מכסה מאופיינים היטב כדי לשלוט באורך כפי שעושה אקטין. השימוש בגרעין ובצמיחה דורש שימוש בריכוזים גבוהים מאוד של טובולין ו- GMPCPP כדי ליצור מיקרוטובולים קצרים. ריכוז טובולין גבוה גורם למספר גדול יותר של חוטים במערכת, מה שמקשה על הפרדת טקטואידים זה מזה. התוספת של כובעי מיקרוטובול חדשים, כגון DARPin33, עשויה לסייע במצב זה. את הבעיה השנייה של המיקרוטובולים להיות חסרי תנועה ניתן למתן על ידי תוספת של חלבונים מוטוריים, כגון kinesin-534, שהם טטרמרים של מנועים המשמשים מיטוזה. לחלופין, ניתן להשתמש בדמרים מלאכותיים של קינזין-1 דימרי15.
דרך נוספת להוסיף נזילות נוספת תהיה לאפשר למיקרוטובולים לבצע את חוסר היציבות הדינמית שלהם, את הגידול וההתכווצות של המיקרוטובולים. נכון לעכשיו, מיקרוטובולים שנזרעים עם חוטי GMPCPP יציבים ולאחר מכן עוברים חוסר יציבות דינמית הם הרבה יותר ארוכים מהרצוי כדי ליצור ציר או טקטואיד, מה שיגרום לארגונים ארוכים מאוד כמו מאווררים או חבילות. לכן, הוספת חוסר יציבות דינמית של מיקרוטובולים תצטרך להיעשות בזהירות כדי לשמור על הצורה הטקטואידית. תוספת של חלבונים ואנזימים נלווים שיכולים לשלוט באורך עשויה למתן בעיה זו. לדוגמה, סביר להניח שיהיה צורך בדה-פולימריזציה של קינזינים, כגון קינזין-1335, או ניתוק אנזימים, כמו קטנין36. ניסויים אלה מורכבים וקשים, אם כי הם יהיו בעלי תובנה רבה לא משנה מה התוצאות יחשפו. לא משנה לאיזה כיוון ילכו הניסויים העתידיים, הפלטפורמה שפותחה כאן ליצירת טקטואידים של מיקרוטובולים יכולה לחשוף מידע חדש על בסיס פיזיקלי של ארגון מיקרוטובולים.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להודות לכל חברי מעבדת רוס בקיץ 2021, במיוחד ק. אליס לינדזי, על עזרתם. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מ- NSF BIO-2134215 שתמך בס ‘סאהו, נ’ גודבי, ה.ב. לי וג’.ל. רוס. מענק מקרן KECK (ריי אנדרסון, USD, lead PI) תמך באופן חלקי בר’ סניף וב-P. Chauhan
Materials
| 2% Dichlorodimethylsilane | GE Healthcare | 118945 | A hydrophobic silane surface treatment. This can be resused upto three times and kept at room temperature for one year. |
| 5-minute epoxy | Bob Smith Industries | For sealing experimental chambers | |
| Acetone | Fisher | 32900HPLC | 100% |
| BL21 cells | Bio Labs | C2527I | Competent bacterial cells used to express MAP65 |
| Catalase | Sigma | C30-500MG | Part of the oxygen scavenging system. A 300 mg/ml stock is made in ddH2O and stored in 10 μl aliquots in -20°C for upto one year. |
| Coverslips (22 mm x 22 mm or 22 mm x 30 mm) | Fisher | 12544-AP | For experimental chambers |
| Dithiothreitol | Sigma | 43815-5G | A small molecule that is used to break disulfide bonds and scavenge oxygen. A 1 M stock is made from powder (Sigma) in ddH2O. The solution is aliquoted and stored at -20C for upto one year. The aliquots are used 7-8 times then discarded. |
| EGTA | Sigma | E3889-10G | Tubulin buffer base ingredient |
| Eppendorf 0.5 ml tubes | Eppendorf | 05 402 18 | For holding experimental solutions |
| Ethanol | Fisher | 111000200 | 200 proof |
| Filter paper | Whatman | 1004-110 | For cleaning and for pulling solutions through experimental chambers |
| Fluorescence microscope with high NA objectives | Nikon | Ti-E, W2 Confocal | For imaging experiments |
| Freezer -20°C | Fisherbrand | 13986148 | For storing reagents |
| Freezer -80°C | Thermo scientific | 328223H01-C | For storing proteins. |
| Glass containers for silanization | Michaels | For preparing experimental chambers – treating cover glasses | |
| Glass slides | Fisher | 12544-4 | For experimental chambers |
| Glucose | Sigma | G7528-250G | Part of the oxygen scavenging system. A 300 mg/ml stock is made in ddH2O and stored in 10 μl aliquots in -20°C. |
| Glucose oxidase | Sigma | G2133-250KU | Part of the oxygen scavenging system. This is stored at 4°C for upto one year. |
| GMPCPP | Jenna Bioscience | NU-4055 | Slowly hydrolyzable analog of GTP used to polymerize and stabilize the microtubules by reducing the dynamic instability and spontaneous critical concentration for microtubule nucleation to get a consistent length. We purchase a 10 mM stock from Jena Biosciences and store it at -20°C for upto one year. |
| Heating element for microscope | Okolab stage top incubator | For imaging experiments | |
| Imidizole | Sigma | I2399 | Used to elute MAP65 protein from Nickel beads to purify MAP65 |
| Kimwipes | Fisher | 34155 | For cleaning and for pulling solutions through experimental chambers. |
| KOH | Sigma | P250-500 | 1 M in ddH2O, made fresh to prevent acidification over time. |
| Liquid Nitrogen | Airgas | NI 230LT22 | To drop freeze aliquots. This can also be used for storage (not recommended) |
| MAP65 protein | Ram Dixit | A microtubule-associated protein (MAP) with a molecular weight of 65 kD that is an antiparallel microtubule crosslinker. We have purified an unlabeled and GFP-labeled version of MAP65-1 from Arabidopsis thaliana. We mix the GFP-MAP65 with the unlabeled MAP65 such that 10% of the protein is labeled. The working stock is a 10.8 μM solution. This working solution is stored at 4°C and remade fresh every week. The protocol for purifying the MAP65 and GFP-MAP65 is given in our prior methods chapter (26). | |
| MgSO4 | Sigma | MKCJ940 | Tubulin buffer ingredient |
| NTA-Nickel beads | Qiagen | 30210 | Beads required to purify 6xHis tagged MAP65 proteins |
| Optomicroscan | Nikon | 405 nm laser system which can focus the laser in any desired shape of region of interest | |
| PEM80 | Neutral tubulin polymerizing base buffer for solution made from 80 mM K-PIPES, pH 6.8, 1 mM MgSO4, 1 mM EGTA, stored at 4°C for upto one year. | ||
| Permanent double-sided tape | 3M – Scotch | 34-8724-5691-7 | For experimental chambers |
| Petri dish | Fisher | FB0875713 | For humid chamber |
| PIPES | Sigma | P7643-100G | Tubulin buffer base ingredient |
| Pluronic-F127 | Sigma | P2443-250G | A block-copolymer with two hydrophilic polyethylene oxide (PEO) blocks on the ends and a hydrophobic center block of polyphenylene oxide (PPO) hydrophobic surface coating we use to prevent protein binding to the surface. Pluronic-F127 is purchased as a powder (Sigma) and dissolved to a 5% (w/v) solution in ddH2O overnight. Once dissolved, the solution can be stored at room temperature for upto one year. |
| Polyethylene Glycol | Affymetrix Inc | 19966 500 GM | A crowding agent used to create depletion forces to bring tactoids to the surface and help to organize microtubules. We create a 5% (w/v) solution of 100 kDa PEG in PEM80. The solution is stored in 4°C for upto one year and placed on the rocker before use. It is viscous, so we recommend using a positive displacement pipette to work with it. |
| Positive displacement pipette | Eppendorf | For pipetting viscous liquids | |
| Racks for coverslips | Electron Microscopy Sciences | 72240 | For preparing experimental chambers – treating cover glasses |
| Refrigerator 4°C | Fisherbrand | For storing reagents | |
| Tubulin Labeled | Cytoskeleton | TL590M | lyophilized rhodamine-labeled tubulin from pig brain is purchased (Cytoskeleton) and stored in -80°C until hydrated in PEM80 and used for upto one year. |
| Tubulin protein | Cytoskeleton | T240 | lyophilized tubulin 99% pure unlabeled from pig brain is purchased (Cytoskeleton) and stored in -80°C until hydrated in PEM80 and used for upto one year. |
| UV-Ozone | Jelight | Model 342 | For preparing experimental chambers – treating cover glasses |
| Stackreg | Biomedical Imaging Group | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/ | plugin for registering time series data to remove drift |
| Turboreg | Biomedical Imaging Group | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ | plugin for registering time series data to remove drift |
References
- Bodakuntla, S., Jijumon, A. S., Villablanca, C., Gonzalez-Billault, C., Janke, C. Microtubule-associated proteins: structuring the cytoskeleton. Trends in Cell Biology. 29 (10), 804-819 (2019).
- Severson, A. F., von Dassow, G., Bowerman, B. Oocyte meiotic spindle assembly and function. Current Topics in Developmental Biology. 116, 65-98 (2016).
- Brugués, J., Needleman, D. Physical basis of spindle self-organization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (52), 18496-18500 (2014).
- Brugués, J., Nuzzo, V., Mazur, E., Needleman, D. J. Nucleation and transport organize microtubules in metaphase spindles. Cell. 149 (3), 554-564 (2012).
- Gatlin, J. C., et al. Spindle fusion requires dynein-mediated sliding of oppositely oriented microtubules. Current Biology. 19 (4), 287-296 (2009).
- Goshima, G., Mayer, M., Zhang, N., Stuurman, N., Vale, R. D. Augmin: A protein complex required for centrosome-independent microtubule generation within the spindle. Journal of Cell Biology. 181 (3), 421-429 (2008).
- Inoue, S., Sato, H. Cell motility by labile association of the nature of mitotic spindle fibers and their role in chromosome movement molecules. Journal of General Physiology. 50 (6), 259-292 (1967).
- Allenspach, A. L., Roth, L. E. Structural variations during mitosis in the chick embryo. Journal of Cell Biology. 33 (1), 179-196 (1967).
- Theg, D. E. Cytoplasmic microtubules in different animal cells. Journal of Cell Biology. 23 (2), 265-275 (1964).
- Mcdonald, K., Pickett-Heaps, J. D., Mcintosh, J. R., Tippit, D. H. On the mechanism of anaphase spindle elongation in Diatoma vulgare. Journal of Cell Biology. 9, 377-388 (1977).
- Chaikin, P. M., Lubensky, T. C. . Principles of Condensed Matter Physics. , (1995).
- Hamon, L., Savarin, P., Curmi, P. A., Pastré, D. Rapid assembly and collective behavior of microtubule bundles in the presence of polyamines. Biophysical Journal. 101 (1), 205 (2011).
- Needleman, D. J., et al. Higher-order assembly of microtubules by counterions: From hexagonal bundles to living necklaces. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (46), 16099-16103 (2004).
- Ross, J. L., Fygenson, D. K. Mobility of taxol in microtubule bundles. Biophysical Journal. 84, 3959-3967 (2003).
- Sanchez, T., Welch, D., Nicastro, D., Dogic, Z. Cilia-like beating of active microtubule bundles. Science. 333 (6041), 456-459 (2011).
- Brandt, R., Lee, G. Functional organization of microtubule-associated protein tau. Identification of regions which affect microtubule growth, nucleation, and bundle formation in vitro. Journal of Biological Chemistry. 268 (5), 3414-3419 (1993).
- Hirokawa, N. Microtubule organization and dynamics dependent on microtubule-associated proteins. Current Opinion in Cell Biology. 6 (1), 74-81 (1994).
- Kanai, Y., et al. Expression of multiple tau isoforms and microtubule bundle formation in fibroblasts transfected with a single tau cDNA. The Journal of Cell Biology. 109 (3), 1173 (1989).
- MacRae, T. H. Microtubule organization by cross-linking and bundling proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA). Protein Structure and Molecular Enzymology. 1160 (2), 145-155 (1992).
- She, Z. Y., Wei, Y. L., Lin, Y., Li, Y. L., Lu, M. H. Mechanisms of the Ase1/PRC1/MAP65 family in central spindle assembly. Biological Reviews. 94 (6), 2033-2048 (2019).
- Walczak, C. E., Shaw, S. L. A MAP for Bundling Microtubules. Cell. 142 (3), 364-367 (2010).
- Edozie, B., et al. Self-organization of spindle-like microtubule structures. Soft Matter. 15 (24), 4797-4807 (2019).
- Tulin, A., McClerklin, S., Huang, Y., Dixit, R. Single-molecule analysis of the microtubule cross-linking protein MAP65-1 reveals a molecular mechanism for contact-angle-dependent microtubule bundling. Biophysical Journal. 102 (4), 802-809 (2012).
- Chan, J., Jensen, C. G., Jensen, L. C. W., Bush, M., Lloyd, C. W. The 65-kDa carrot microtubule-associated protein forms regularly arranged filamentous cross-bridges between microtubules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (26), 14931-14936 (1999).
- Scheff, D. R., et al. Tuning shape and internal structure of protein droplets via biopolymer filaments. Soft Matter. 16 (24), 5659-5668 (2020).
- Weirich, K. L., et al. Liquid behavior of cross-linked actin bundles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2131-2136 (2017).
- Weirich, K. L., Dasbiswas, K., Witten, T. A., Vaikuntanathan, S., Gardel, M. L. Self-organizing motors divide active liquid droplets. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 166 (23), 11125-11130 (2019).
- Sahu, S., Herbst, L., Quinn, R., Ross, J. L. Crowder and surface effects on self-organization of microtubules. Physical Review E. 103 (6), 062408 (2021).
- Stanhope, K. T., Ross, J. L. Microtubules, MAPs, and motor patterns. Methods in Cell Biology. 128, 23-38 (2015).
- Early Middle Ages drop single.jpg. Wikimedia Commons Available from: https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Early_middle_ages_drop_spingle.jpg (2022)
- Lantzsch, I., et al. Microtubule reorganization during female meiosis in c. Elegans. eLife. 10, 58903 (2021).
- Advani, S., Maresca, T. J., Ross, J. L. Creation and testing of a new, local microtubule-disruption tool based on the microtubule-severing enzyme, katanin p60. Cytoskeleton. 75 (12), 531-544 (2018).
- Pecqueur, L., et al. A designed ankyrin repeat protein selected to bind to tubulin caps the microtubule plus end. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (30), 12011-12016 (2012).
- Valentine, M. T., Fordyce, P. M., Krzysiak, T. C., Gilbert, S. P., Block, S. M. Individual dimers of the mitotic kinesin motor Eg5 step processively and support substantial loads in vitro. Nature Cell Biology. 8 (5), 470-476 (2006).
- Wagenbach, M., Domnitz, S., Wordeman, L., Cooper, J. A kinesin-13 mutant catalytically depolymerizes microtubules in ADP. Journal of Cell Biology. 183 (4), 617-623 (2008).
- McNally, F. J., Vale, R. D. Identification of katanin, an ATPase that severs and disassembles stable microtubules. Cell. 75 (3), 419-429 (1993).
