التجميع الذاتي لل Tactoids microtubule
Summary
تقدم هذه المقالة بروتوكولا لتشكيل تجمعات الأنابيب الدقيقة على شكل تاكتويد باستخدام MAP65 ، وهو رابط متقاطع للأنابيب الدقيقة نباتي ، و PEG كعامل ازدحام.
Abstract
الهيكل الخلوي هو المسؤول عن التنظيم الداخلي الرئيسي وإعادة التنظيم داخل الخلية ، وكل ذلك بدون مدير لتوجيه التغييرات. هذا هو الحال بشكل خاص أثناء الانقسام أو الانقسام الاختزالي ، حيث تشكل الأنابيب الدقيقة المغزل أثناء انقسام الخلايا. المغزل هو الآلية المستخدمة لفصل المواد الوراثية أثناء انقسام الخلايا. نحو إنشاء مغزل ذاتي التنظيم في المختبر ، قمنا مؤخرا بتطوير تقنية لإعادة تشكيل الأنابيب الدقيقة في مجموعات تشبه المغزل مع الحد الأدنى من البروتينات المرتبطة بالأنابيب الدقيقة وعوامل الازدحام. على وجه التحديد ، تم استخدام MAP65 ، وهو رابط متقاطع مضاد للأنابيب الدقيقة من النباتات ، وهو تجانس Ase1 من الخميرة و PRC1 من الكائنات الحية الثدييات. يقوم هذا الوصلة المتقاطعة بتنظيم الأنابيب الدقيقة ذاتيا في مجموعات طويلة ورقيقة تشبه المغزل ذاتية التنظيم للأنابيب الدقيقة. تشبه هذه التجميعات أيضا اللباقات البلورية السائلة ، ويمكن استخدام الأنابيب الدقيقة كميزوجينات متوسطة الحجم. هنا ، يتم تقديم بروتوكولات لإنشاء هذه اللباقات microtubule ، وكذلك لتوصيف شكل التجميعات باستخدام الفحص المجهري الفلوري وحركة المكونات باستخدام استرداد التألق بعد التبييض الضوئي.
Introduction
انقسام الخلايا عن طريق الانقسام هو واحد من أهم العمليات البيولوجية للحفاظ على الحياة. خيوط الأنابيب الدقيقة ، التي تتكون من ديمرات توبولين ، هي عناصر هيكلية أساسية لهذه العملية. تسمى الآلية العابرة التي تم إنشاؤها في مرحلة ما قبل الطور عندما تكون الكروموسومات محاذاة في مركز الخلية المغزل الانقسامي بسبب شكله ، والذي يشبه مغزل نول مغطى بخيوط (الشكل 1A). من الثابت عبر العديد من الكائنات الحية أن الأنابيب الدقيقة تستخدم في الطور الفوقي لدفع وسحب الكروموسومات المكثفة إلى وسط الخلية ، ومحاذاتها وربطها بالأنابيب الدقيقة التي ستسحبها بعيدا في الطور (الشكل 1B ، C). يتشكل المغزل في كل من الانقسام الاختزالي (الشكل 1B) والانقسام (الشكل 1C) ، الذي تم إنشاؤه من العديد من الأنابيب الدقيقة المتداخلة غير الملفوفة حول المحور المركزي مثل الخيط ولكنها تعمل بالتوازي مع الواجهة. يتطلب إنشاء هذه الهياكل القائمة على الأنابيب الدقيقة بروتينات مرتبطة ترتبط بالإنزيمات المرتبطة بها والإنزيمات المرتبطة بها والتي يمكن أن تعمل كمحركات للمساعدة في دفع وسحب الكروموسومات1.
أظهرت الدراسات التي أجريت على المغزل الوسيط أن الأنابيب الدقيقة قصيرة وديناميكية ومتداخلة في المصفوفات المتقاطعة2،3،4،5،6 (الشكل 1Di). نظرا للتنظيم الفيزيائي لهذه الأنابيب الدقيقة القصيرة ، فإن المغزل meiotic يشبه تاكتويد الكريستال السائل (الشكل 1E). في الواقع ، ثبت أن المغزل يتجمع ويندمج ، كما يتوقع المرء من اللباقة البلورية السائلة5.
استخدمت العديد من الدراسات التي يعود تاريخها إلى 1960s التثبيت ، والمقاطع التسلسلية ، والمجهر الإلكتروني لتحديد أن هناك نوعين من الأنابيب الدقيقة داخل المغزل الانقسامي7،8،9،10. النوع الأول يسمى الأنابيب الدقيقة kinetochore ، والتي تربط قطب المغزل ب kinetochore. النوع الثاني يسمى الأنابيب الدقيقة بين الأقطاب أو القطبية ، والتي تنمو بعد الكروموسومات وتتداخل في المنطقة الوسطى (الشكل 1Dii)8,9,10. وهناك نوع ثالث يسمى الأنابيب الدقيقة النجمية ، والتي تقع خارج المغزل وتربط القطبين بحافة الخلية. منظمات الأنابيب الدقيقة هذه خارج نطاق المناقشة الحالية. كانت هناك دراسات حديثة حول التفاعل بين الأوجمين6 ومجمع حلقة غاما توبولين الذي يؤثر على مراكز التنوي للأنابيب الدقيقة ، مما أدى إلى مغزل انقسامي مع أنابيب دقيقة أقصر كما هو الحال في الشكل 1D.
نظرا لأن الأنابيب الدقيقة أطول من عرضها ، مع نسبة عرض إلى ارتفاع عالية وصلابة عالية ، فهي تشبه الإصدارات الموسعة من جزيئات الكريستال السائل. في فيزياء المادة اللينة، تم تقريب الذرات والجزيئات باستخدام الحد الأدنى من التفاعلات لاستنتاج الآليات الفيزيائية لانتقالات الطور، بما في ذلك النوى وذوبان البلورات11. وبالمثل ، فإن الأنابيب الدقيقة هي أجسام متوسطة الحجم هي نسخ موسعة من جزيئات البلورات السائلة ، مما يعطي نظرة ثاقبة لفيزياء ديناميكيات البلورات السائلة ، بما في ذلك نواة ونمو المراحل الخيطية من تلك المتساوية الخواص. علاوة على ذلك ، كما نوقش أعلاه ، يعرض المغزل meiotic خصائص مثل خصائص tactoid البلورية السائلة ، وهي حالة نيماتية تنوي وتنمو من الحالة المتساوية لجزيئات الكريستال السائل 3,4,5. بالنسبة لل tactoids ، فإن النوى والنمو يشبهان نمو البلورات الأخرى (أي تتطلب تركيزا عاليا نسبيا من الميزوجينات [الجزيئات التي تشكل بلورات سائلة]). يأتي شكل “المغزل” الفريد من نوعه للتاكتويد من المحاذاة المحلية للميزوجينات البلورية السائلة التي تتماشى مع الطور الخيطي (الشكل 1E). لا يمكنهم تشكيل بلورة مستديرة لأن الجزيئات غير متماثلة للغاية. بالنظر إلى طبيعة الأنابيب الدقيقة ، ربما ليس من المستغرب أن تكون آلات المغزل الانقسامية المصنوعة من تركيز محلي عال من الأنابيب الدقيقة هي أيضا من نفس الشكل ، سواء كانت تسمى tactoid أو المغزل. يمكن أن تكون اللباقات ثنائية القطب ، مع أقطاب في النهايات المدببة (الشكل 1Ei) ، أو متجانسة ، مع أقطاب فعالة في اللانهاية (الشكل 1Eii).
نظرا لأهمية تكوين المغزل ، كانت الجهود جارية نحو تكوين المغزل المنظم ذاتيا في المختبر من خلال إظهار تكثيف الأنابيب الدقيقة في حزم عبر الأنواع الأيونية 12,13 ، وعوامل الازدحام التي تخلق تفاعلات النضوب 14,15 ، وبروتينات محددة متقاطعة للأنابيب الدقيقة13,16,17,18,19 ، 21. من المثير للدهشة أنه على الرغم من أن هذه العوامل تعمل جميعها على زيادة التركيز المحلي للأنابيب الدقيقة ، إلا أنها غالبا ما تؤدي إلى حزم طويلة من الأنابيب الدقيقة ولكن ليس اللباقات. قد يكون أحد الأسباب التي تجعل هذه الحزم طويلة هو أن الأنابيب الدقيقة التي تتكون منها طويلة أيضا. كما أفادت الأعمال الأخيرة التي استخدمت الأنابيب الدقيقة الأقصر عن حزم أطول غير مدببة في نهاية15؛ في هذه الحالة ، يتم الاحتفاظ بالحزم مع البروتينات الحركية التي تسبب امتداد الحزم ، وبالتالي تجعلها أطول. هناك حاجة إلى أنابيب دقيقة قصيرة مع وصلات متقاطعة غير قابلة للتمدد للتجميعات المدببة التي تشبه المغزل ، كما هو موضح هنا.
في الآونة الأخيرة ، قمنا بتطوير تقنية لتمكين إنشاء tactoids microtubule باستخدام crosslinker المضادة للتوازي ، MAP65 ، في وجود microtubules22 المستقرة النووية. يجب أن تكون الأنابيب الدقيقة قصيرة ، ولكن القليل من المنظمين المعروفين لطول الأنابيب الدقيقة يمكنهم الحد من الأنابيب الدقيقة ضد عدم الاستقرار الديناميكي أو التلدين من طرف إلى طرف. بدلا من ذلك ، تم استخدام GMPCPP لنواة واستقرار الخيوط بعد النمو. سمح هذا بإنشاء كثافة عالية من الأنابيب الدقيقة القصيرة التي يمكن أن تنظم نفسها في اللباقة. كانت هذه اللباقات متجانسة عند النظر إليها تحت الانكسار المزدوج. بالإضافة إلى الأنابيب الدقيقة القصيرة ، تم استخدام رابط متقاطع محدد مضاد للتوازي ، MAP65 ، لتشكيل tactoids (الشكل 2). MAP65 هو بروتين مرتبط بالأنابيب الدقيقة النباتية في عائلة PRC1 / Ase1 من الروابط المتقاطعة الانقسامية23. يوجد MAP65 كخافت ، مع تقارب قوي للارتباط بنفسه وكذلك الأنابيب الدقيقة24. على عكس المغزل الوسيط و tactoids التي لوحظت مع خيوط الأكتين25،26،27 ، والتي هي ثنائية القطب ولها خصائص تشبه السائل من البلورات السائلة ، وقد لوحظ أن tactoids microtubule تشبه الصلبة22,28.
هنا ، يتم تقديم بروتوكولات لإنشاء tactoids microtubule وتوصيف شكل التجمعات وحركة المكونات باستخدام التقنيات القائمة على التألق.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم استخدام الطرق الموضحة هنا في العديد من الأوراق لإنشاء تاكتويدات الأنابيب الدقيقة (الشكل 2) 22,28. هذه التجارب ذات صلة بيولوجية للمساعدة في الكشف عن المبادئ التنظيمية التي تتحكم في شكل واستقرار المغزل الانقسامي أو الوسيط في معظم أنواع الخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الأنابيب الدقيقة هي نموذج للميسوجينات البلورية السائلة التي يمكن أن تساعد في معرفة المزيد حول كيفية نواة البلورات السائلة ونمو المراحل الخيطية من المراحل متساوي الخواص.
الإجراء الموضح هنا له العديد من المزايا لاستكشاف التنظيم الذاتي للأنابيب الدقيقة. أولا ، إنه قابل للتكرار بشكل كبير ، حيث تم إجراؤه في المختبر من قبل العديد من الطلاب ، بما في ذلك طلاب المدارس الثانوية ، مع القليل من المعرفة المسبقة أو التدريب قبل البدء في المختبر. اللباقات ثنائية الانعكاس22 ، مما يسمح برؤيتها في الضوء المنقول بالإضافة إلى الفحص المجهري الفلوري ، مما يجعل هذه الطريقة في متناول العديد من المختبرات وهذا الإجراء التجريبي قابل للتكيف مع الأغراض التعليمية ، بالإضافة إلى الأبحاث الراقية. وأخيرا، تفتح هذه العملية آفاقا لمواصلة فهم الأنظمة البيولوجية والتحقيق فيها في نهج مختزل وتجريدي، مما يسمح للمرء بفهم كيف يمكن لكل حالة إضافية أو بروتين أو مادة مضافة أن تغير التنظيم الذاتي لللباقات، وربما في نهاية المطاف، المغزل. تشمل أهداف المحاكاة الحيوية الأفضل النشاط والسيولة وفرز قطبية الخيوط.
يمكن أن يكون هناك العديد من العوامل التي تؤثر على التجربة مما يعطي نتائج غير متوقعة. على سبيل المثال ، إذا لم تتشكل اللباقات (الشكل 2) ولكن لوحظت أنماط تشبه المروحة ، فمن المحتمل ألا يكون MAP65 موجودا أو غير ملزم بالأنابيب الدقيقة22,28. يجب أن يكون هذا واضحا في قناة التألق MAP65 أيضا لأن GFP-MAP65 لن يكون مرتبطا بالأنابيب الدقيقة.
إذا لم تتشكل اللباقات وظهرت الخلفية كبقع على الزجاج ، فقد يكون هذا بسبب طلاء السطح. بمجرد القيام به ، يستمر silanization فقط 1 شهر على coverslips. عندما يزول ، سيكون التوبولين قادرا على الارتباط بالسطح المكشوف بشكل غير محدد. سيحدث هذا الربط في أنماط غريبة.
إذا لم تتشكل اللباقات ولوحظ التوبولين في مجاميع من مختلف الأشكال والأحجام ، فقد يكون هذا بسبب التوبولين ذي الجودة الرديئة. يمكن طرد التوبولين مركزيا لإزالة المجاميع الأولية التي يمكن أن تدفع هذا التجميع خارج المسار بدلا من بلمرة الأنابيب الدقيقة. إذا كان السطح مرتبطا بالتوبولين ، فيمكنه أيضا استنفاد التوبولين في المحلول. يمكن أن تؤدي التركيزات المنخفضة من التوبولين ، أقل من التركيز الحرج لبلمرة الأنابيب الدقيقة ، إلى مجاميع.
في تجارب FRAP ، إذا لم تظهر قناة MAP65 أي استرداد (الشكل 5) ، فمن المحتمل أن يكون التبييض الضوئي قد ألحق الضرر الضوئي بالأنابيب الدقيقة. يتسبب الضرر الضوئي في التدمير الموضعي للخيوط. يمكن التحقق من ذلك عن طريق الفحص في القناة المرسلة. يمكن رؤية اللباقات ذات الأنابيب الدقيقة في القناة المنقولة من خلال مؤشر مرتفع لعدم تطابق الانكسار مع الماء المحيط. سيظهر الضرر الضوئي الناجم عن الضوء كعلامة حرق أو فقدان التباين في التصوير الضوئي المنقول في موقع عائد الاستثمار الخاضع للتبييض الضوئي. إذا حدث هذا ، يجب تقليل طاقة الليزر أو الضوء لمنع التلف الضوئي للبروتينات.
وكانت هناك العديد من التحديات التي تمت مواجهتها في هذا الإجراء والنهج. إحدى المشكلات هي أن قياسات الطول يتم تنفيذها حاليا يدويا بالنقر فوق الصورة. هذه الطريقة ، على الرغم من أنها واضحة ، يمكن أن تؤدي إلى درجة عالية من عدم اليقين. يعد قياس العرض الذي يستخدم المقطع العرضي والملائم للغاوسي طريقة أفضل لقياس الحجم. ويمكن استخدام طريقة مماثلة للطول. القضية الثانية هي أنه في بعض الأحيان ، يمكن أن تنحني اللباقة ، لأنها طويلة ورقيقة جدا. هذا يجعل تحديد الطول أكثر صعوبة. يمكن تحديد طول الكفاف كميا باستخدام خط مجزأ ، ولكن هناك عدم يقين إضافي في كل مرة تتم فيها إضافة مقطع.
من منظور علمي ، يواجه هذا النهج بعض التحديات الأخرى لاستخدامه كنموذج للبلورات السائلة أو المغزل. كان التحدي الأول هو الشكل الطويل والرقيق للكتل التي تخلقها الأنابيب الدقيقة (الشكل 3 والشكل 4). وكما لوحظ في المنشورات السابقة22 ، فإن تاكتويد الأنابيب الدقيقة هي تاكتويد متجانسة ، وليست ثنائية القطب. هذا يعني أن الأنابيب الدقيقة التي تشكل الشكل لا تعيد التوجيه للإشارة إلى أطراف الهيكل. بدلا من ذلك ، تكون جميع الأنابيب الدقيقة موازية للمحور الطويل وتقع “القطبين” في ما لا نهاية. هذا يختلف اختلافا كبيرا عن tactoids التي لوحظت للبلورات السائلة الجزيئية أو حتى للأكتين أو الحمض النووي التي يمكن أن تعمل أيضا كميسوجينات بلورية سائلة. في هذه الأنظمة الأخرى ، تكون اللباقة ثنائية القطب ، وعندما ينظر إليها في المستقطبات المتقاطعة ، فإنها تظهر علامات منبهة لإعادة توجيه القضبان.
التحدي الرئيسي الثاني في هذا النظام هو أن الأنابيب الدقيقة غير متحركة داخل اللباقة. هذا واضح من تجارب وتحليل FRAP لأن استعادة الأنابيب الدقيقة منخفضة للغاية. طبيعتها الشبيهة بالصلبة تجعل تاكتويدات الأنابيب الدقيقة أقل قيمة مثل نظائرها البلورية السائلة واسعة النطاق. يجب أن يكون للمرحلة الخيطية للبلورة السائلة خصائص سائلة (سائلة) وبلورية (منظمة). على الرغم من أن الشكل يبدو مناسبا للمغزل ، إلا أن الجمود يجعل النظام أقل إثارة كمغزل ميتوتيكي نموذجي. من ناحية أخرى ، توفر هذه المشكلة فرصا للتحقيق في كيفية تعديل التجارب لخلق المزيد من السيولة في النظام.
توفر هذه التحديات العلمية فرصا مثيرة من شأنها أن تسمح بمعرفة جديدة حول النظام. لجعل tactoids microtubule أكثر ثنائية القطب ، يمكن للمرء استخدام microtubules أقصر. ومع ذلك ، هناك تحد إضافي ، لأن الأنابيب الدقيقة لا تحتوي على العديد من بروتينات السد المميزة جيدا للتحكم في الطول كما يفعل الأكتين. يتطلب استخدام النوى والنمو استخدام تركيزات عالية جدا من التوبولين و GMPCPP لصنع أنابيب دقيقة قصيرة. ينتج عن تركيز التوبولين العالي عدد أكبر من الخيوط في النظام ، مما يجعل من الصعب فصل اللباقة عن بعضها البعض. قد تساعد إضافة أغطية الأنابيب الدقيقة الجديدة ، مثل DARPin33 ، في هذا الموقف. يمكن التخفيف من المشكلة الثانية المتمثلة في أن الأنابيب الدقيقة غير متحركة عن طريق إضافة البروتينات الحركية ، مثل kinesin-534 ، والتي هي رباعيات المحركات المستخدمة في الانقسام الخيطي. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام dimers الاصطناعية من dimeric kinesin-115.
هناك طريقة أخرى لإضافة المزيد من السيولة تتمثل في السماح للأنابيب الدقيقة بأداء عدم استقرارها الديناميكي ، ونمو وتقلص الأنابيب الدقيقة. حاليا ، الأنابيب الدقيقة التي يتم زرعها بخيوط GMPCPP مستقرة ثم تخضع لعدم الاستقرار الديناميكي أطول بكثير من المطلوب لتشكيل مغزل أو لباقة ، مما قد يؤدي إلى منظمات طويلة جدا مثل المراوح أو الحزم. لذلك ، يجب إضافة عدم الاستقرار الديناميكي للأنابيب الدقيقة بعناية للحفاظ على شكل التاكتويد. إضافة البروتينات والإنزيمات المرتبطة التي يمكن أن تتحكم في الطول قد تخفف من هذه المشكلة. على سبيل المثال ، من المحتمل أن تكون هناك حاجة إلى إزالة البلمرة من الكينيسين ، مثل كينيسين-13 35 ، أو قطع الإنزيمات ، مثل الكاتانين36. هذه التجارب معقدة وصعبة ، على الرغم من أنها ستكون ثاقبة للغاية بغض النظر عما تكشفه النتائج. أيا كان الاتجاه الذي تتخذه التجارب المستقبلية ، فإن المنصة التي تم تطويرها هنا لإنشاء tactoids microtubule يمكن أن تكشف عن معلومات جديدة على الأساس المادي لتنظيم microtubule.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود المؤلفون أن يشكروا جميع أعضاء مختبر روس لصيف 2021 ، وخاصة K. Alice Lindsay ، على مساعدتهم. تم دعم هذا العمل من خلال منحة من NSF BIO-2134215 التي دعمت S. Sahu و N. Goodbee و H.B. Lee و J.L. Ross. منحة من مؤسسة KECK (راي أندرسون ، دولار أمريكي ، PI الرئيسي) دعمت جزئيا R. Branch و P. Chauhan
Materials
| 2% Dichlorodimethylsilane | GE Healthcare | 118945 | A hydrophobic silane surface treatment. This can be resused upto three times and kept at room temperature for one year. |
| 5-minute epoxy | Bob Smith Industries | For sealing experimental chambers | |
| Acetone | Fisher | 32900HPLC | 100% |
| BL21 cells | Bio Labs | C2527I | Competent bacterial cells used to express MAP65 |
| Catalase | Sigma | C30-500MG | Part of the oxygen scavenging system. A 300 mg/ml stock is made in ddH2O and stored in 10 μl aliquots in -20°C for upto one year. |
| Coverslips (22 mm x 22 mm or 22 mm x 30 mm) | Fisher | 12544-AP | For experimental chambers |
| Dithiothreitol | Sigma | 43815-5G | A small molecule that is used to break disulfide bonds and scavenge oxygen. A 1 M stock is made from powder (Sigma) in ddH2O. The solution is aliquoted and stored at -20C for upto one year. The aliquots are used 7-8 times then discarded. |
| EGTA | Sigma | E3889-10G | Tubulin buffer base ingredient |
| Eppendorf 0.5 ml tubes | Eppendorf | 05 402 18 | For holding experimental solutions |
| Ethanol | Fisher | 111000200 | 200 proof |
| Filter paper | Whatman | 1004-110 | For cleaning and for pulling solutions through experimental chambers |
| Fluorescence microscope with high NA objectives | Nikon | Ti-E, W2 Confocal | For imaging experiments |
| Freezer -20°C | Fisherbrand | 13986148 | For storing reagents |
| Freezer -80°C | Thermo scientific | 328223H01-C | For storing proteins. |
| Glass containers for silanization | Michaels | For preparing experimental chambers – treating cover glasses | |
| Glass slides | Fisher | 12544-4 | For experimental chambers |
| Glucose | Sigma | G7528-250G | Part of the oxygen scavenging system. A 300 mg/ml stock is made in ddH2O and stored in 10 μl aliquots in -20°C. |
| Glucose oxidase | Sigma | G2133-250KU | Part of the oxygen scavenging system. This is stored at 4°C for upto one year. |
| GMPCPP | Jenna Bioscience | NU-4055 | Slowly hydrolyzable analog of GTP used to polymerize and stabilize the microtubules by reducing the dynamic instability and spontaneous critical concentration for microtubule nucleation to get a consistent length. We purchase a 10 mM stock from Jena Biosciences and store it at -20°C for upto one year. |
| Heating element for microscope | Okolab stage top incubator | For imaging experiments | |
| Imidizole | Sigma | I2399 | Used to elute MAP65 protein from Nickel beads to purify MAP65 |
| Kimwipes | Fisher | 34155 | For cleaning and for pulling solutions through experimental chambers. |
| KOH | Sigma | P250-500 | 1 M in ddH2O, made fresh to prevent acidification over time. |
| Liquid Nitrogen | Airgas | NI 230LT22 | To drop freeze aliquots. This can also be used for storage (not recommended) |
| MAP65 protein | Ram Dixit | A microtubule-associated protein (MAP) with a molecular weight of 65 kD that is an antiparallel microtubule crosslinker. We have purified an unlabeled and GFP-labeled version of MAP65-1 from Arabidopsis thaliana. We mix the GFP-MAP65 with the unlabeled MAP65 such that 10% of the protein is labeled. The working stock is a 10.8 μM solution. This working solution is stored at 4°C and remade fresh every week. The protocol for purifying the MAP65 and GFP-MAP65 is given in our prior methods chapter (26). | |
| MgSO4 | Sigma | MKCJ940 | Tubulin buffer ingredient |
| NTA-Nickel beads | Qiagen | 30210 | Beads required to purify 6xHis tagged MAP65 proteins |
| Optomicroscan | Nikon | 405 nm laser system which can focus the laser in any desired shape of region of interest | |
| PEM80 | Neutral tubulin polymerizing base buffer for solution made from 80 mM K-PIPES, pH 6.8, 1 mM MgSO4, 1 mM EGTA, stored at 4°C for upto one year. | ||
| Permanent double-sided tape | 3M – Scotch | 34-8724-5691-7 | For experimental chambers |
| Petri dish | Fisher | FB0875713 | For humid chamber |
| PIPES | Sigma | P7643-100G | Tubulin buffer base ingredient |
| Pluronic-F127 | Sigma | P2443-250G | A block-copolymer with two hydrophilic polyethylene oxide (PEO) blocks on the ends and a hydrophobic center block of polyphenylene oxide (PPO) hydrophobic surface coating we use to prevent protein binding to the surface. Pluronic-F127 is purchased as a powder (Sigma) and dissolved to a 5% (w/v) solution in ddH2O overnight. Once dissolved, the solution can be stored at room temperature for upto one year. |
| Polyethylene Glycol | Affymetrix Inc | 19966 500 GM | A crowding agent used to create depletion forces to bring tactoids to the surface and help to organize microtubules. We create a 5% (w/v) solution of 100 kDa PEG in PEM80. The solution is stored in 4°C for upto one year and placed on the rocker before use. It is viscous, so we recommend using a positive displacement pipette to work with it. |
| Positive displacement pipette | Eppendorf | For pipetting viscous liquids | |
| Racks for coverslips | Electron Microscopy Sciences | 72240 | For preparing experimental chambers – treating cover glasses |
| Refrigerator 4°C | Fisherbrand | For storing reagents | |
| Tubulin Labeled | Cytoskeleton | TL590M | lyophilized rhodamine-labeled tubulin from pig brain is purchased (Cytoskeleton) and stored in -80°C until hydrated in PEM80 and used for upto one year. |
| Tubulin protein | Cytoskeleton | T240 | lyophilized tubulin 99% pure unlabeled from pig brain is purchased (Cytoskeleton) and stored in -80°C until hydrated in PEM80 and used for upto one year. |
| UV-Ozone | Jelight | Model 342 | For preparing experimental chambers – treating cover glasses |
| Stackreg | Biomedical Imaging Group | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/ | plugin for registering time series data to remove drift |
| Turboreg | Biomedical Imaging Group | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ | plugin for registering time series data to remove drift |
References
- Bodakuntla, S., Jijumon, A. S., Villablanca, C., Gonzalez-Billault, C., Janke, C. Microtubule-associated proteins: structuring the cytoskeleton. Trends in Cell Biology. 29 (10), 804-819 (2019).
- Severson, A. F., von Dassow, G., Bowerman, B. Oocyte meiotic spindle assembly and function. Current Topics in Developmental Biology. 116, 65-98 (2016).
- Brugués, J., Needleman, D. Physical basis of spindle self-organization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (52), 18496-18500 (2014).
- Brugués, J., Nuzzo, V., Mazur, E., Needleman, D. J. Nucleation and transport organize microtubules in metaphase spindles. Cell. 149 (3), 554-564 (2012).
- Gatlin, J. C., et al. Spindle fusion requires dynein-mediated sliding of oppositely oriented microtubules. Current Biology. 19 (4), 287-296 (2009).
- Goshima, G., Mayer, M., Zhang, N., Stuurman, N., Vale, R. D. Augmin: A protein complex required for centrosome-independent microtubule generation within the spindle. Journal of Cell Biology. 181 (3), 421-429 (2008).
- Inoue, S., Sato, H. Cell motility by labile association of the nature of mitotic spindle fibers and their role in chromosome movement molecules. Journal of General Physiology. 50 (6), 259-292 (1967).
- Allenspach, A. L., Roth, L. E. Structural variations during mitosis in the chick embryo. Journal of Cell Biology. 33 (1), 179-196 (1967).
- Theg, D. E. Cytoplasmic microtubules in different animal cells. Journal of Cell Biology. 23 (2), 265-275 (1964).
- Mcdonald, K., Pickett-Heaps, J. D., Mcintosh, J. R., Tippit, D. H. On the mechanism of anaphase spindle elongation in Diatoma vulgare. Journal of Cell Biology. 9, 377-388 (1977).
- Chaikin, P. M., Lubensky, T. C. . Principles of Condensed Matter Physics. , (1995).
- Hamon, L., Savarin, P., Curmi, P. A., Pastré, D. Rapid assembly and collective behavior of microtubule bundles in the presence of polyamines. Biophysical Journal. 101 (1), 205 (2011).
- Needleman, D. J., et al. Higher-order assembly of microtubules by counterions: From hexagonal bundles to living necklaces. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (46), 16099-16103 (2004).
- Ross, J. L., Fygenson, D. K. Mobility of taxol in microtubule bundles. Biophysical Journal. 84, 3959-3967 (2003).
- Sanchez, T., Welch, D., Nicastro, D., Dogic, Z. Cilia-like beating of active microtubule bundles. Science. 333 (6041), 456-459 (2011).
- Brandt, R., Lee, G. Functional organization of microtubule-associated protein tau. Identification of regions which affect microtubule growth, nucleation, and bundle formation in vitro. Journal of Biological Chemistry. 268 (5), 3414-3419 (1993).
- Hirokawa, N. Microtubule organization and dynamics dependent on microtubule-associated proteins. Current Opinion in Cell Biology. 6 (1), 74-81 (1994).
- Kanai, Y., et al. Expression of multiple tau isoforms and microtubule bundle formation in fibroblasts transfected with a single tau cDNA. The Journal of Cell Biology. 109 (3), 1173 (1989).
- MacRae, T. H. Microtubule organization by cross-linking and bundling proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA). Protein Structure and Molecular Enzymology. 1160 (2), 145-155 (1992).
- She, Z. Y., Wei, Y. L., Lin, Y., Li, Y. L., Lu, M. H. Mechanisms of the Ase1/PRC1/MAP65 family in central spindle assembly. Biological Reviews. 94 (6), 2033-2048 (2019).
- Walczak, C. E., Shaw, S. L. A MAP for Bundling Microtubules. Cell. 142 (3), 364-367 (2010).
- Edozie, B., et al. Self-organization of spindle-like microtubule structures. Soft Matter. 15 (24), 4797-4807 (2019).
- Tulin, A., McClerklin, S., Huang, Y., Dixit, R. Single-molecule analysis of the microtubule cross-linking protein MAP65-1 reveals a molecular mechanism for contact-angle-dependent microtubule bundling. Biophysical Journal. 102 (4), 802-809 (2012).
- Chan, J., Jensen, C. G., Jensen, L. C. W., Bush, M., Lloyd, C. W. The 65-kDa carrot microtubule-associated protein forms regularly arranged filamentous cross-bridges between microtubules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (26), 14931-14936 (1999).
- Scheff, D. R., et al. Tuning shape and internal structure of protein droplets via biopolymer filaments. Soft Matter. 16 (24), 5659-5668 (2020).
- Weirich, K. L., et al. Liquid behavior of cross-linked actin bundles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2131-2136 (2017).
- Weirich, K. L., Dasbiswas, K., Witten, T. A., Vaikuntanathan, S., Gardel, M. L. Self-organizing motors divide active liquid droplets. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 166 (23), 11125-11130 (2019).
- Sahu, S., Herbst, L., Quinn, R., Ross, J. L. Crowder and surface effects on self-organization of microtubules. Physical Review E. 103 (6), 062408 (2021).
- Stanhope, K. T., Ross, J. L. Microtubules, MAPs, and motor patterns. Methods in Cell Biology. 128, 23-38 (2015).
- Early Middle Ages drop single.jpg. Wikimedia Commons Available from: https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Early_middle_ages_drop_spingle.jpg (2022)
- Lantzsch, I., et al. Microtubule reorganization during female meiosis in c. Elegans. eLife. 10, 58903 (2021).
- Advani, S., Maresca, T. J., Ross, J. L. Creation and testing of a new, local microtubule-disruption tool based on the microtubule-severing enzyme, katanin p60. Cytoskeleton. 75 (12), 531-544 (2018).
- Pecqueur, L., et al. A designed ankyrin repeat protein selected to bind to tubulin caps the microtubule plus end. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (30), 12011-12016 (2012).
- Valentine, M. T., Fordyce, P. M., Krzysiak, T. C., Gilbert, S. P., Block, S. M. Individual dimers of the mitotic kinesin motor Eg5 step processively and support substantial loads in vitro. Nature Cell Biology. 8 (5), 470-476 (2006).
- Wagenbach, M., Domnitz, S., Wordeman, L., Cooper, J. A kinesin-13 mutant catalytically depolymerizes microtubules in ADP. Journal of Cell Biology. 183 (4), 617-623 (2008).
- McNally, F. J., Vale, R. D. Identification of katanin, an ATPase that severs and disassembles stable microtubules. Cell. 75 (3), 419-429 (1993).
