Summary

磁気ナノ粒子を用いたイムノアッセイのための千鳥制限を有するマイクロ流体アクリルデバイスのコンピュータ数値制御マイクロミリング

Published: June 23, 2022
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Summary

マイクロフルイディクスは、診断テストを開発するための強力なツールです。ただし、高価な機器と材料、および面倒な製造と取り扱い技術がしばしば必要とされます。ここでは、低コストで使いやすい設定での磁気マイクロおよびナノ粒子ベースのイムノアッセイ用のアクリルマイクロ流体デバイスの製造プロトコルについて詳しく説明します。

Abstract

マイクロ流体システムは、イムノアッセイ技術を大幅に改善しました。しかし、多くの微細加工技術は、特殊な、高価、または複雑な装置を必要とするため、製造コストがかかり、大量生産と互換性がなく、ポイントオブケアテスト(POCT)を低リソース環境で採用するための最も重要な前提条件の1つです。この研究では、コンピューター数値制御(CNC)マイクロミリング技術を使用したナノ粒子結合酵素イムノアッセイ試験用のアクリル(ポリメチルメタクリレート、PMMA)デバイスの製造プロセスについて説明します。マイクロ流体デバイスの機能は、100nm磁性ナノ粒子に結合したモデル抗原としてリゾチームを使用して市販の抗体を検出するイムノアッセイを行うことによって示されます。このデバイスは、高さわずか5μmの物理的な千鳥制限を統合し、外部磁石を配置することによって磁気トラップを構成する磁性微粒子を捕捉するために使用されます。このようにして、コンジュゲートナノ粒子の免疫支持体にかかる磁力は、それらを捕捉し、流れの抗力に抵抗するのに十分である。このマイクロ流体デバイスは、イムノアッセイ性能の精度を損なうことなく、低コストの大量生産に特に適しています。

Introduction

近年、マイクロフルイディクスはイムノアッセイ技術において重要な役割を果たしています1。小型化技術には、サンプルと試薬の消費量の削減、インキュベーション時間の短縮、効率的な溶液交換、高度な統合と自動化など、従来のイムノアッセイと比較して多くの優れた利点があります2

さらに、イムノアッセイにおけるマイクロ流体システムは、免疫支持体としての磁性ナノ粒子と会合して、インキュベーション時間を大幅に短縮し、表面対体積比の増加により高い検出感度を達成します3。粒子のブラウン運動は、抗原抗体複合体4,5の形成中の反応速度を改善する。さらに、ナノ粒子の磁気特性は、さまざまなマイクロ流体デバイス構成に統合する汎用性を提供し、小型化されたオンチップバイオセンシングシステムにおけるシグナル伝達および分子捕捉の理想的な候補となります5。しかし、磁力は表面対体積比が高いため、ナノメートルスケールの抗力よりも大幅に弱くなります6。したがって、洗浄や検出などの重要なイムノアッセイステップのためにナノ粒子を捕捉することは困難な場合があり、従来の磁石では不十分です4

ナノ粒子を操作する効率的な方法は、マイクロ流体構造体3に充填された鉄微粒子によって形成されたマイクロ流体磁気トラップの使用である。したがって、外部の磁石が近づくと、磁化された多孔質媒体内で磁力と磁束力の間に複雑な相互作用が生じます。ナノ粒子に作用する磁力は、ナノ粒子を捕捉し、流れの抗力に抵抗するのに十分強い3,4,7。このアプローチでは、微粒子を保持するマイクロメトリック構造を生成するために、数マイクロメートルオーダーの分解能を達成する微細加工技術が必要です。

現在の微細加工技術により、数ミクロンから数百ナノメートルの構造の高解像度製造が可能になります8。ただし、これらの技術の多くは、特殊な、高価な、または複雑な機器を必要とします。主な困難の1つは、金型製造のためのクリーンルームの要件であり、これは依然としてコストと時間のかかる8,9です。最近、マイクロ流体エンジニアは、コストの削減、ターンアラウンドタイムの短縮、材料とツールの安価化、機能性の向上など、さまざまな利点を備えたさまざまな代替製造方法を開発することで、この欠点を克服しています8。このように、新しい微細加工技術の開発により、10μm8という低い分解能を達成する低コストの非クリーンルーム法がもたらされました。パターニングは、高価な成形パターンを生成することなく基板上に直接使用できるため、時間のかかるプロセスを回避できます。直接製造方法には、CNCフライス盤、レーザーアブレーション、および直接リソグラフィーが含まれます8。これらの方法はすべて、硬度9に関係なく、幅広い材料で高アスペクト比チャネルを製造するのに適しており、マイクロ流体デバイス8で新しく有利な形状、物理的挙動、および品質を可能にします。

CNCマイクロミリングは、基板からバルク材料を除去する切削工具を使用してマイクロスケール構造を作成し、マイクロ流体デバイス10,11の効果的な製造方法です。マイクロミリング技術は、マイクロ流体アプリケーションでマイクロチャネルと機能を作業面に直接作成するのに役立ち、ワークピースを短時間で(30分未満)製造でき、設計からプロトタイプまでのターンアラウンドタイムを大幅に短縮できるという主な利点を提供します12。さらに、さまざまな材料、サイズ、および形状の切断アクセサリが広く利用できるため、CNCフライス盤は、多くの種類の低コストの使い捨て材料でさまざまな機能の製造を可能にする適切なツールになります13

マイクロミリングで一般的に使用されるすべての材料の中で、熱可塑性プラスチックは、その多くの好ましい特性と生物学的用途との互換性のために、依然として主要な選択肢です10,14。熱可塑性プラスチックは、低コストの使い捨て分析システムを開発するための大きな利点があるため、マイクロ流体システムにとって魅力的な基板です9。また、大量生産プロセスへの適応性が高く、製品化や量産に適しています。これらの理由から、PMMAなどの熱可塑性プラスチックは、マイクロフルイディクスの初期から信頼性が高く堅牢な材料と見なされてきました10。熱可塑性プラスチックの閉チャネルを製造するためのさまざまなプロトコル、例えば、溶剤接合15、熱接合16、および紫外線(UV)/オゾン表面処理接合17が記載されている。

多くの場合、従来のマイクロミリングマシンで達成される位置決め分解能は、10μm未満の構造を必要とする一部のマイクロ流体アプリケーションでは十分ではありません。ハイエンドのマイクロミリングには十分な解像度があります。残念ながら、価格が高いため、その使用は少数のユーザーに限定されています12。以前、私たちの研究グループは、従来のフライス盤の解像度を克服して、10μm未満の構造を加工できる低コストの工具の製造と操作を報告しました12。フィクスチャは、3つの圧電アクチュエータを含む、シンプルな電子機器で3D印刷によって製造されたプラットフォームです。表面にはヒンジ状のジョイントが含まれており、圧電素子が同時に作用するときに持ち上げることができます。Z軸変位は、500nmの分解能と±1.5μmの精度で制御できます12

この論文では、マイクロミリング技術によるアクリルデバイス(PMMA)の製造プロセスのステップを紹介します。チップ設計は、幅200μm、高さ200μmのメインチャネルと、試薬の流れをパージするための同じ寸法のサイドチャネルで構成されています。中央領域では、このグループ12によって製造された3Dプリントされた圧電プラットフォームで製造された高さわずか5μmの物理的制限によってチャネルが中断され、外部磁石を配置することによってナノ粒子の磁気トラップを構成する磁性微粒子を捕捉する。100 nm磁性ナノ粒子に結合したモデル抗原としてリゾチームを用いて市販の抗体を検出するイムノアッセイを行うことによるマイクロ流体デバイスの動作を示す。このデバイスは、それをユニークにするさまざまな機能を兼ね備えています4:免疫サポートとして磁性ナノ粒子を使用すると、合計テスト時間が数時間から数分に短縮されます。検出に蛍光発生酵素を使用すると、標準的な酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)に匹敵する検出限界が可能になります。また、熱可塑性プラスチックを製造材料として使用することで、従来のマイクロ流体ナノ粒子の磁気トラップ3にはなかった大量生産に対応でき、POCTの開発に最適な候補となります。

Protocol

1.マイクロミリング 平面研削マイクロフライス盤と圧電コントローラーの電源を入れます。それぞれの制御ソフトウェア12を起動する。 必要なエンドミルビット(直径200 μmおよび800 μm)を選択します。フライス盤の適切なコンパートメントに配置します(図1)。 厚さ1.3 mmのPMMAの9 mm x 25 mmの長方形を800 μmのエンド…

Representative Results

従来のマイクロミリング技術の分解能を向上させる再現性の高い製造プロトコルを確立することができました。このプロトコルを使用して、高さ200 μmのチャネルで互い違いの制限として機能する高さ5 μmの小さなチャネルの作成が達成されます。千鳥状制限のシンプルな設計により、直径7.5μmの鉄微粒子を捕捉し、マイクロチャネルで圧縮すると、外部磁石がデバイスに近づいたときに磁気?…

Discussion

ナノ粒子を免疫担体として用いた免疫測定用のアクリルマイクロ流体デバイスをマイクロミリング技術を用いて作製した。基板上で直接製造する方法は、マスターモールドの使用およびこれが意味する時間とコストを回避するという利点を有する。ただし、ラピッドプロトタイピングと大量生産に限定されます。

ここでは、既報の補機用圧電台用フライス盤<sup class="xref"…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、メキシコのConacytが「Programa de Apoyos para Actividades Científicas, Tecnológics y de Innovación」の助成金312231の下で、AMEXCIDとメキシコ外交省(SRE)によって「Prueba serológica rápida, barata y de alta sensibilidad para SARS-CoV-2」の助成金の下で支援されました。JAHOは、コナシットメキシコの博士課程奨学金に感謝します。

Materials

0.008 Endmill KYOCERA SGS  2204 2FL 0.008×1/8×0.12×1-1/12
0.032 Endmill KYOCERA SGS  2228 2FL 0.032×1/8×0.48×1-1/12
Carbonyl-iron microparticles  Sigma-Aldrich 44890 7 μm 
Chloroform Fermont 6201 Health Hazard: Moderate
Flammability: None
Reactivity: None
Contact Hazard: Moderate 
CMOS camera Moment Teledyne Photometrics Sensor Technology: CMOS
Quantum Efficiency: 73%
Pixel Size: 4.5 µm x 4.5 µm
Supported Interfaces: USB 3.2 Gen 2
Dr Engrave Software Roland DGA Corporation Engraving software to design and create the engraving path on the surface
Extraction hood Unknown Unknown
Flexible Plastic Tubing Tygon AAD04103 ID = 0.020, OD = 0.060
Fluorescence microsope  ZEISS Axio Vert.A1
High Precision Dispense Needle Loctite 98612
Homemade piezoelectric controller application LabView  See reference 12 for more details.
Loctite 495 instant adhesive Henkel 49503 Apply with micropipette tip or dispensing needle 
MagJET Separation Rack thermoscientific 12 x 1.5 mL
Mechanic press Home-made
Milling Machine Roland MDX-50
Piezoelectric platform  Home-made See reference 12
Polymethylmethacrylate – Sheet – PMMA, Acrylic Goodfellow ME303018/1 Thickness: 1.3 mm, Transparency: Clear/Transparent
PVCamTest software Teledyne Photometrics Version 3.10.107  Image acquisition software
Stereo microscope Nikon SMZ 7457
SuperMag Carboxyl Beads Ocean NanoTech KSC0100 100 nm
Syringe pump kd Scientific  KDS200 Can hold up to two syringes
Utrasonic bath Branson 2800
VPanel software  Windows OS Version 1.0.3.0 Software for controlling the micromilling machine

References

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Citer Cet Article
Hernández-Ortiz, J. A., Guevara-Pantoja, P. E., Andrade-Medina, M., Carrillo-Tripp, M., Caballero-Robledo, G. A. Computer Numerical Control Micromilling of a Microfluidic Acrylic Device with a Staggered Restriction for Magnetic Nanoparticle-Based Immunoassays. J. Vis. Exp. (184), e63899, doi:10.3791/63899 (2022).

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