Manyetik Nanopartikül Bazlı İmmünoassaylar için Kademeli Bir Kısıtlama ile Mikroakışkan Akrilik Cihazın Bilgisayar Sayısal Kontrol Mikrofrezelenmesi
Summary
Mikroakışkanlar, tanısal testlerin geliştirilmesi için güçlü bir araçtır. Bununla birlikte, pahalı ekipman ve malzemelerin yanı sıra zahmetli imalat ve taşıma teknikleri de sıklıkla gereklidir. Burada, manyetik mikro ve nanopartikül bazlı immünotahliller için akrilik bir mikroakışkan cihazın üretim protokolünü düşük maliyetli ve kullanımı kolay bir ortamda detaylandırıyoruz.
Abstract
Mikroakışkan sistemler immünoassay tekniklerini büyük ölçüde geliştirmiştir. Bununla birlikte, birçok mikrofabrikasyon tekniği uzmanlaşmış, pahalı veya karmaşık ekipman gerektirir, bu da imalatın maliyetli olmasını ve düşük kaynak ortamlarında benimsenecek bakım noktası testlerinin (POCT) en önemli ön koşullarından biri olan seri üretimle uyumsuz olmasını sağlar. Bu çalışma, bilgisayarlı sayısal kontrol (CNC) mikrofrezeleme tekniğini kullanarak nanopartikül konjuge enzimatik immünoassay testi için bir akrilik (polimetilmetakrilat, PMMA) cihazının üretim sürecini açıklamaktadır. Mikroakışkan cihazın işleyişi, 100 nm manyetik nanopartiküllere konjuge edilmiş bir model antijen olarak lizozim kullanarak ticari bir antikoru tespit etmek için bir immünoassay yapılarak gösterilir. Bu cihaz, harici bir mıknatıs yerleştirerek manyetik bir tuzak oluşturan manyetik mikropartikülleri yakalamak için kullanılan, yalnızca 5 μm yüksekliğinde fiziksel kademeli bir kısıtlamayı bütünleştirir. Bu şekilde, konjuge nanopartiküllerin immün desteği üzerindeki manyetik kuvvet, onları yakalamak ve akış sürüklenmesine direnmek için yeterlidir. Bu mikroakışkan cihaz, immünoassay performansı için hassasiyet kaybı olmadan düşük maliyetli seri üretim için özellikle uygundur.
Introduction
Son yıllarda, mikroakışkanlar immünoassay tekniklerinde önemli bir rol oynamıştır1. Minyatürleştirme teknolojisi, geleneksel immünotahlillere kıyasla daha az numune ve reaktif tüketimi, daha kısa inkübasyon süreleri, verimli çözelti değişimi ve daha yüksek entegrasyonve otomasyon 2 gibi birçok olağanüstü avantaja sahiptir.
Ayrıca, immünotahlillerdeki mikroakışkan sistemler, immünodestek olarak manyetik nanopartiküllerle birlikte, inkübasyon sürelerini önemli ölçüde azaltır ve artan yüzey-hacim oranı nedeniyle yüksek algılama hassasiyeti elde eder3. Parçacıkların Brownian hareketi, antijen-antikor kompleksi 4,5’in oluşumu sırasında reaksiyon kinetiğini geliştirir. Dahası, nanopartiküllerin manyetik özellikleri, farklı mikroakışkan cihaz konfigürasyonlarına entegre edilmek üzere çok yönlülük sağlar, bu da onları minyatür çip üstü biyosensing sistemlerinde sinyal ve molekül yakalama için ideal bir aday haline getirir5. Bununla birlikte, manyetik kuvvetler, yüksek yüzey-hacim oranı6 nedeniyle nanometre ölçeğinde sürükleme kuvvetlerinden önemli ölçüde daha zayıftır. Bu nedenle, yıkama ve algılama gibi önemli immünoassay adımları için nanopartiküllerin yakalanması zor olabilir ve geleneksel bir mıknatıs yetersizdir4.
Nanopartikülleri manipüle etmenin etkili bir yolu, mikroakışkan bir yapıda paketlenmiş demir mikropartikülleri tarafından oluşturulan mikroakışkan manyetik bir tuzağın kullanılmasıdır3. Bu nedenle, harici bir mıknatıs yaklaştığında, manyetik ve akı kuvvetleri arasında mıknatıslanmış gözenekli ortam içinde karmaşık bir etkileşim yaratılır. Nanopartiküllere etki eden manyetik kuvvet, onları yakalamak ve akış sürüklenmesine direnmek için yeterince güçlüdür 3,4,7. Bu yaklaşım, mikropartikülleri tutan mikrometrik yapılar oluşturmak için birkaç mikrometre düzeyinde çözünürlükler elde eden mikrofabrikasyon teknikleri gerektirir.
Mevcut mikrofabrikasyon teknikleri, yapıların birkaç mikrondan yüzlerce nanometreye kadar yüksek çözünürlüklü imalatına izin verir8. Bununla birlikte, bu tekniklerin çoğu uzmanlaşmış, pahalı veya karmaşık ekipman gerektirir. Başlıca zorluklardan biri, pahalı ve zaman alıcı 8,9 olan kalıp üretimi için temiz bir oda gereksinimidir. Son zamanlarda, mikroakışkan mühendisleri, azaltılmış maliyetler, daha hızlı geri dönüş süreleri, daha ucuz malzemeler ve aletler ve artan işlevsellik gibi çeşitli avantajlarla çeşitli alternatif imalat yöntemleri geliştirerek bu dezavantajı aşmışlardır8. Bu şekilde, yeni mikrofabrikasyon tekniklerinin geliştirilmesi, 10 μm8’e kadar düşük çözünürlüklere ulaşan düşük maliyetli, temiz oda dışı yöntemler getirdi. Desenleme, pahalı bir kalıplama deseni oluşturmadan doğrudan bir substrat üzerinde kullanılabilir, böylece zaman alıcı bir işlemden kaçınılır. Doğrudan imalat yöntemleri arasında CNC frezeleme, lazer ablasyon ve doğrudan litografi8 bulunur. Tüm bu yöntemler, sertliklerine bakılmaksızın çok çeşitli malzemelerde yüksek en boy oranına sahip kanallar üretmek için uygundur9, mikroakışkan cihazlarda yeni ve avantajlı geometriler, fiziksel davranışlar ve niteliklersağlar 8.
CNC mikro frezeleme, bir alt tabakadan dökme malzemeyi çıkaran kesici aletler kullanarak mikro ölçekli yapılar oluşturur ve mikroakışkan cihazlar için etkili bir imalat yöntemidir10,11. Mikrofrezeleme tekniği, mikroakışkan uygulamalarda doğrudan çalışma yüzeyinde mikro kanallar ve özellikler oluşturmak için yararlı olabilir ve önemli bir avantaj sunar: bir iş parçası kısa sürede (30 dakikadan az) üretilebilir ve tasarımdan prototip12’ye geri dönüş süresini önemli ölçüde azaltır. Ek olarak, farklı malzemelerden, boyutlardan ve şekillerden kesme aksesuarlarının geniş kullanılabilirliği, CNC freze makinelerini birçok düşük maliyetli tek kullanımlık malzeme türünde farklı özelliklerin üretilmesine izin veren uygun bir araç haline getirir13.
Mikrofrezelemede yaygın olarak kullanılan tüm malzemeler arasında, termoplastikler birçok olumlu özellikleri ve biyolojik uygulamalarla uyumluluğu nedeniyle lider bir seçim olmaya devam etmektedir10,14. Termoplastikler, düşük maliyetli, tek kullanımlık analitik sistemler geliştirmek için önemli avantajları nedeniyle mikroakışkan sistemler için çekici bir substrattır9. Ek olarak, bu malzemeler yüksek hacimli üretim süreçlerine oldukça uygundur, bu da onları ticarileştirme ve seri üretim için uygun hale getirir. Bu nedenlerden dolayı, PMMA gibi termoplastikler, mikroakışkanların ilk yıllarından beri güvenilir ve sağlam malzemeler olarak kabul edilmiştir10. Termoplastiklerde solvent yapıştırma15, ısı yapıştırma16 ve ultraviyole (UV) / ozon yüzey işleme yapıştırma17 gibi kapalı kanallar üretmek için farklı protokoller tanımlanmıştır.
Çoğu durumda, geleneksel mikro freze makineleri ile elde edilen konumlandırma çözünürlüğü, 10 μm’den küçük yapılar gerektiren bazı mikroakışkan uygulamalar için yeterli değildir. Üst düzey mikro frezeleme yeterli çözünürlüğe sahiptir. Ne yazık ki, yüksek fiyatlar nedeniyle, kullanımı bir avuç kullanıcıyla sınırlıdır12. Daha önce, araştırma grubumuz, geleneksel freze makinelerinin çözünürlüğünün üstesinden gelerek, 10 μm’den daha az işleme yapılarına izin veren düşük maliyetli bir takımın imalatını ve manipülasyonunu bildirmiştir12. Fikstür, üç piezoelektrik aktüatör içeren, basit elektroniklerle 3D baskı ile üretilen bir platformdur. Yüzey, piezoelektrik elemanlar aynı anda hareket ettiğinde kaldırılmasını sağlayan menteşe şeklindeki eklemler içerir. Z ekseni yer değiştirmesi, 500 nm çözünürlük ve ±1,5 μm12 hassasiyetle kontrol edilebilir.
Bu yazıda, bir mikrofrezeleme tekniği ile bir akrilik cihazın (PMMA) üretim sürecinin adımları sunulmaktadır. Talaş tasarımı, 200 μm genişliğinde ve 200 μm yüksekliğinde bir ana kanaldan ve reaktiflerin akışını temizlemek için aynı boyutlara sahip bir yan kanaldan oluşur. Merkezi bölgede, kanal, harici bir mıknatıs yerleştirerek nanopartiküller için manyetik bir tuzak oluşturan manyetik mikropartikülleri yakalamak için bu grup12 tarafından yapılan 3D baskılı piezoelektrik platform ile imal edilen sadece 5 μm yüksekliğinde fiziksel bir kısıtlama ile kesintiye uğrar. Mikroakışkan cihazın çalışmalarını, 100 nm manyetik nanopartiküllere konjuge edilmiş bir model antijen olarak lizozim kullanarak ticari bir antikoru tespit etmek için bir immünoassay yaparak gösteriyoruz. Bu cihaz, onu benzersiz kılan farklı özellikleri bir araya getirir4: manyetik nanopartiküllerin bağışıklık desteği olarak kullanılması, toplam test süresini saatlerden dakikalara düşürür; Tespit için florojenik bir enzim kullanmak, standart enzime bağlı immünosorbent tahlilleriyle (ELISA’lar) karşılaştırılabilir tespit sınırlarına izin verir; ve bir termoplastiğin bir imalat malzemesi olarak kullanılması, önceki mikroakışkan nanopartiküllerin manyetik tuzakları3 için geçerli olmayan seri üretimle uyumlu hale getirir ve POCT’yi geliştirmek için mükemmel bir aday haline getirir.
Protocol
Representative Results
Discussion
İmmüno-destek olarak nanopartikülleri kullanan immünotahliller için akrilik bir mikroakışkan cihaz, bir mikrofrezeleme tekniği kullanılarak üretildi. Substrat üzerinde doğrudan üretim yöntemi, bir ana kalıbın kullanımından ve bunun ima ettiği zaman ve maliyetlerden kaçınma avantajına sahiptir. Bununla birlikte, hızlı prototipleme ve yüksek hacimli cihaz üretimi ile sınırlıdır.
Burada, freze makinesi12 için daha önce bildirilen bir aksesua…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Conacyt, Meksika tarafından “Programa de Apoyos para Actividades Científicas, Tecnológicas y de Innovación” hibe 312231 ve AMEXCID ve Meksika Dış İlişkiler Bakanlığı (SRE) tarafından “Prueba serológica rápida, barata y de alta sensibilidad para SARS-CoV-2” hibesi altında desteklenmiştir. JAHO, doktora bursu için Conacyt Mexico’ya teşekkür ediyor.
Materials
| 0.008 Endmill | KYOCERA SGS | 2204 | 2FL 0.008×1/8×0.12×1-1/12 |
| 0.032 Endmill | KYOCERA SGS | 2228 | 2FL 0.032×1/8×0.48×1-1/12 |
| Carbonyl-iron microparticles | Sigma-Aldrich | 44890 | 7 μm |
| Chloroform | Fermont | 6201 | Health Hazard: Moderate Flammability: None Reactivity: None Contact Hazard: Moderate |
| CMOS camera Moment | Teledyne Photometrics | Sensor Technology: CMOS Quantum Efficiency: 73% Pixel Size: 4.5 µm x 4.5 µm Supported Interfaces: USB 3.2 Gen 2 |
|
| Dr Engrave Software | Roland DGA Corporation | Engraving software to design and create the engraving path on the surface | |
| Extraction hood | Unknown | Unknown | |
| Flexible Plastic Tubing | Tygon | AAD04103 | ID = 0.020, OD = 0.060 |
| Fluorescence microsope | ZEISS | Axio Vert.A1 | |
| High Precision Dispense Needle | Loctite | 98612 | |
| Homemade piezoelectric controller application | LabView | See reference 12 for more details. | |
| Loctite 495 instant adhesive | Henkel | 49503 | Apply with micropipette tip or dispensing needle |
| MagJET Separation Rack | thermoscientific | 12 x 1.5 mL | |
| Mechanic press | Home-made | ||
| Milling Machine | Roland | MDX-50 | |
| Piezoelectric platform | Home-made | See reference 12 | |
| Polymethylmethacrylate – Sheet – PMMA, Acrylic | Goodfellow | ME303018/1 | Thickness: 1.3 mm, Transparency: Clear/Transparent |
| PVCamTest software | Teledyne Photometrics | Version 3.10.107 | Image acquisition software |
| Stereo microscope | Nikon | SMZ 7457 | |
| SuperMag Carboxyl Beads | Ocean NanoTech | KSC0100 | 100 nm |
| Syringe pump | kd Scientific | KDS200 | Can hold up to two syringes |
| Utrasonic bath | Branson | 2800 | |
| VPanel software | Windows OS | Version 1.0.3.0 | Software for controlling the micromilling machine |
References
- Ng, A. H. C., Uddayasankar, U., Wheeler, A. R. Immunoassays in microfluidic systems. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (3), 991-1007 (2010).
- Berlanda, S. F., Breitfeld, M., Dietsche, C. L., Dittrich, P. S. Recent advances in microfluidic technology for bioanalysis and diagnostics. Analytical Chemistry. 93 (1), 311-331 (2021).
- Teste, B., et al. Microchip integrating magnetic nanoparticles for allergy diagnosis. Lab on a Chip. 11 (24), 4207-4213 (2011).
- Guevara-Pantoja, P. E., Sánchez-Domínguez, M., Caballero-Robledo, G. A. Micro-nanoparticles magnetic trap: Toward high sensitivity and rapid microfluidic continuous flow enzyme immunoassay. Biomicrofluidics. 14 (1), 014111 (2020).
- Khizar, S., et al. Magnetic nanoparticles in microfluidic and sensing: From transport to detection. Electrophoresis. 41 (13-14), 1206-1224 (2020).
- Podaru, G., Chikan, V. CHAPTER 1: Magnetism in nanomaterials: Heat and force from colloidal magnetic particles. Magnetic Nanomaterials: Applications in Catalysis and Life Sciences. , 1-24 (2017).
- Reynoso-Hernández, K. B., Guevara-Pantoja, P. E., Caballero-Robledo, G. A. Capture efficiency of magnetic nanoparticles through the compaction effect of a microparticles column. Physical Review E. 104 (2), 024603 (2021).
- Gale, B. K., et al. A review of current methods in microfluidic device fabrication and future commercialization prospects. Inventions. 3 (3), 60 (2018).
- Liu, K., Fan, Z. H. Thermoplastic microfluidic devices and their applications in protein and DNA analysis. Analyst. 136 (7), 1288-1297 (2011).
- Guckenberger, D. J., de Groot, T. E., Wan, A. M. D., Beebe, D. J., Young, E. W. K. Micromilling: A method for ultra-rapid prototyping of plastic microfluidic devices. Lab on a Chip. 15 (11), 2364-2378 (2015).
- Guevara-Pantoja, P. E., Jiménez-Valdés, R. J., García-Cordero, J. L., Caballero-Robledo, G. A. Pressure-actuated monolithic acrylic microfluidic valves and pumps. Lab on a Chip. 18 (4), 662-669 (2018).
- Guevara-Pantoja, P. E., Chavez-Pineda, O. G., Solis-Serrano, A. M., Garcia-Cordero, J. L., Caballero-Robledo, G. A. An affordable 3D-printed positioner fixture improves the resolution of conventional milling for easy prototyping of acrylic microfluidic devices. Lab on a Chip. 20 (17), 3179-3186 (2020).
- Friedrich, C. R., Vasile, M. J. Development of the micromilling process for high-aspect-ratio microstructures. Journal of Microelectromechanical Systems. 5 (1), 33-38 (1996).
- Malayath, G., Sidpara, A. M., Deb, S. Study of different materials response in micro milling using four edged micro end mill tools. Journal of Manufacturing Processes. 56, 169-179 (2020).
- Jiang, J., et al. A single low-cost microfabrication approach for polymethylmethacrylate, polystyrene, polycarbonate and polysulfone based microdevices. RSC Advances. 5 (45), 36036-36043 (2015).
- Sun, Y., Kwok, Y. C., Nguyen, N. T. Low-pressure, high-temperature thermal bonding of polymeric microfluidic devices and their applications for electrophoretic separation. Journal of Micromechanics and Microengineering. 16 (8), 1681-1688 (2006).
- Tsao, C. W., Hromada, L., Liu, J., Kumar, P., DeVoe, D. L. Low temperature bonding of PMMA and COC microfluidic substrates using UV/ozone surface treatment. Lab on a Chip. 7 (4), 499-505 (2007).
- Bamshad, A., Nikfarjam, A., Khaleghi, H. A new simple and fast thermally-solvent assisted method to bond PMMA-PMMA in micro-fluidics devices. Journal of Micromechanics and Microengineering. 26 (6), 065017 (2016).
- Ogilvie, I. R. G., et al. Reduction of surface roughness for optical quality microfluidic devices in PMMA and COC. Journal of Micromechanics and Microengineering. 20 (6), 065016 (2010).
