電界効果バイオセンシング技術を用いた分子シャペロンHsp90とそのクライアントプロテインキナーゼCdc37との生体分子相互作用の探索

生体分子相互作用:
タンパク質は生物の不可欠な部分であり、細胞代謝、細胞構造、細胞シグナル伝達、免疫応答、細胞接着などの多数の分子経路に関与する。一部のタンパク質は独立してその機能を果たすが、ほとんどのタンパク質は結合界面を使用して他のタンパク質と相互作用し、適切な生物学的活性を調整する¹。

生体分子相互作用は、主に、タンパク質表面、複合体安定性、または相互作用の持続性に基づいて、関与するタンパク質²の明確な構造的および機能的特性に基づいて分類することができる³。生体分子相互作用における必須タンパク質とその役割を同定することは、分子レベルでの生化学的メカニズムを理解するために不可欠です⁴。現在、これらの相互作用⁵を検出するための様々なアプローチがある:インビトロ⁶、インシリコ⁷、生細胞⁸、エキソビボ⁹、およびインビボ¹⁰において、それぞれ独自の長所および短所を有する。

インビボアッセイは、実験ツール¹¹として全動物を用いて行われ、theエキソビボアッセイは、自然条件下で最小限の変化を提供することによって、制御された外部環境において組織抽出物または全器官(例えば、心臓、脳、肝臓)に対して行われる。in vivoおよびex vivo研究の最も一般的な用途は、潜在的な薬理学的薬剤の全体的な安全性および有効性を確保することによって、ヒト試験前に潜在的な薬理学的薬剤の薬物動態、薬力学、および毒性効果を評価することである¹²。

生体分子相互作用は、生細胞内でも検出することができる。生細胞をイメージングすることで、特定の生化学的経路¹³の反応を実行する際の動的相互作用を観察することができます。さらに、生物発光または蛍光共鳴エネルギー移動などの検出技術は、これらの相互作用が細胞¹⁴内でどこでいつ起こるかについての情報を提供することができる。生細胞での検出は重要な詳細を提供しますが、これらの検出方法は光学と標識に依存しており、ネイティブの生物学を反映していない可能性があります。また、 in vitro 法よりも制御が弱く、¹⁵を実行するには専門的な専門知識が必要です。

インシリコ計算法は、主にin vitro実験前の標的分子の大規模スクリーニングに使用されます。計算予測方法、コンピュータベースのデータベース、分子ドッキング、定量的構造活性関係、および他の分子動力学シミュレーションアプローチは、十分に確立されたインシリコツール^16の1つである。面倒な実験手法と比較して、in silicoツールは高感度で簡単に予測を行うことができますが、予測性能の精度は低下します¹⁷。

インビトロ アッセイは、標準的な生物学的文脈の外側の微生物または生体分子を用いて行われる。 in vitro 法による生体分子相互作用の描写は、タンパク質の機能と細胞機能の複雑なネットワークの背後にある生物学を理解するために不可欠です。好ましいアッセイ方法論は、タンパク質の固有の特性、速度論的値、ならびに相互作用の様式および強度に従って選択される^18、19。

Hsp90/Cdc37 の相互作用:
Hsp90とCdc37をつなぐシャペロンキナーゼ経路は、腫瘍生物学²⁰において有望な治療標的である。Hsp90は、細胞周期制御、タンパク質集合、細胞生存、およびシグナル伝達経路において中心的な役割を果たす。Hsp90に依存しているタンパク質は、Cdc37などのコシャペロンを介して複合体形成のためにHsp90に送達されます。Hsp90/Cdc37複合体は、ほとんどのプロテインキナーゼのフォールディングを制御し、多数の細胞内シグナル伝達ネットワーク²¹のハブとして機能する。これは、急性骨髄芽球性白血病、多発性骨髄腫、および肝細胞癌を含む様々な悪性腫瘍におけるその上昇のために有望な抗腫瘍標的である^22,23。

一般的に使用される インビトロ 生体分子相互作用検出技術
共免疫沈降法(co−IP)は、生物学的に関連する相互作用を同定するために抗原抗体特異性に依存する技術^である24。この方法の主な欠点は、低親和性相互作用および動力学的値²⁴を検出できないことである。等温滴定熱量測定(ITC)、表面プラズモン共鳴(SPR)、生体層干渉法(BLI)、FEB技術などの生物物理学的方法が、速度論的値を決定するために好ましい。

ITCは、生体分子相互作用を特徴付けるための完全な熱力学分析とともに結合エネルギーの決定に基づく生物物理学的検出方法である²⁵。ITCの主な利点は、標的タンパク質の標識または固定を必要としないことである。ITCが遭遇する主な困難は、1つの実験に必要な高濃度の標的タンパク質と、小さな結合エンタル^ピー26による非共有結合複合体の分析の困難さである。SPRおよびBLIはいずれも、センサー表面上の標的分子の固定化に依存し、続いて固定化標的^27、28に対する分析物のその後の注入に依存する標識のない生物物理学的技術である。SPRでは、生体分子相互作用中の屈折率の変化が測定される²⁷;BLIでは、反射光の干渉は、時間²⁸の関数として波長の変化としてリアルタイムで記録される。SPRとBLIはどちらも、高い特異性、感度、検出機能を提供するという共通の利点を共有しています²⁹。両方の方法において、標的タンパク質はバイオセンサ表面に固定化されており、したがって、標的の天然の立体構造がいくらか失われる可能性があり、これは特異的相互作用と非特異的相互作用を区別することを困難にする³⁰。BLIは、標的を固定化するために高価な使い捨て光ファイバーバイオセンサを使用するので、コストのかかる技術³¹である。これらの十分に確立された生体分子検出ツールと比較して、FEB技術は、動力学的特性評価を伴うリアルタイムでの生体分子検出に低ナノモル濃度を使用することにより、信頼性が高くラベルフリーのプラットフォームを提供します。FEB技術は、ITCが直面するバブリングの課題も克服し、SPRやBLIと比較して費用対効果が高くなります。

電界効果トランジスタ(FET)ベースのバイオセンサは、さまざまな生物医学的アプリケーションを提供することにより、生体分子相互作用を検出するための新しい分野です。FETシステムでは、ターゲットはバイオセンサチップに固定化され、相互作用はコンダクタンス³²の変化によって検出される。効率的な電子バイオセンサの開発において考慮されるべきユニークな特徴は、センサ表面³³を作製するために使用されるコーティング材料の半導電性の性質および化学的安定性などの物理化学的特性である。FETに使用されるシリコンのような従来の材料は、トランジスタチャネルと適切に機能するために特定の環境との間に挟まれた酸化物層を必要とするため、センサの感度を制限してきた³⁴。さらに、シリコントランジスタは高塩分環境に敏感であるため、自然環境での生物学的相互作用を測定することは困難です。グラフェンベースのバイオセンサは、優れた化学的安定性と電場を提供するため、代替品として提示されています。グラフェンは炭素の単一原子層であるため、半導体として非常に敏感であり、生物学的溶液と化学的に互換性があります。これらの品質の両方が、互換性のある電子バイオセンサ³⁵を生成するのに望ましい。グラフェンコーティングされたバイオセンサによって提供される生体分子の顕著な超高負荷ポテンシャルは、グラフェンベースのバイオセンサFEB技術の開発につながる。

FEB技術の原理:FEBは、結合標的が固定化されているグラフェンバイオセンサを通る電流を測定するラベルフリーの生体分子検出技術です。固定化タンパク質と分析物との間の相互作用は、リアルタイムでモニターされる電流の変化をもたらし、正確な動態測定を可能にする³⁶。

計装:FEBシステムは、グラフェン電界効果トランジスタ(gFET)センサーチップと、実験全体を通して一定の電圧を印加する電子リーダで構成されています(図1)。検体は、バイオセンサ表面に固定化された標的タンパク質に溶液中で塗布される。相互作用が発生すると、電流の変化が測定され、リアルタイムで記録されます。分析物濃度が増加するにつれて、結合した分析物の割合も増加し、電流のより高い交替を引き起こします。装置に付属の自動分析ソフトウェア(材料表)を使用して、I-Responseはバイオセンシングユニット(BU)³⁷の観点から測定および記録されます。I-Responseは、固定化ターゲットと分析物との相互作用時にリアルタイムで測定されるバイオセンサーチップを通る電流(I)の変化として定義されます。FEB自動解析ソフトウェアは、C応答が静電容量(C)の変化を記録する動的相互作用イベントに対するI応答とC応答の両方を解析できます。I-ResponseとC-Responseの両方の変動は、結合した分析物のフラクションに直接対応し、さらに分析_してKD 値を生成することができます。自動分析ソフトウェアのデフォルトの設定はI-Responseです。

図1:実験セットアップの概要 (A)グラフェンベースのチップと電子リーダ。(B)チップ部品の概要。チップは、システムに電流を供給する2つの電極に取り付けられています。チップの表面はグラフェンで覆われており、活性化されると標的を結合することができる。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

方法論：
最初に、活性化バイオセンサーチップをFEBデバイスに挿入し(図1)、その後、以下に概説する手順を実行します:(1)キャリブレーション:実験は、1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH = 7.4)を使用してベースライン平衡化応答を作成するシステムキャリブレーションから始まります。(2)アソシエーション:分析物をチップに導入し、結合飽和に達するまでI-Responseを監視します。(3)解離:分析物を1x PBSを用いて解離させる。(4)再生:1x PBSを用いて検体の残骸を除去する。(5)洗浄:チップから結合および非結合の分析物を完全に除去するために、1x PBSを使用して合計5回の洗浄を行う。

解析：
データ分析は、機器に付属の完全自動ソフトウェアを使用して実行されます。自動解析ソフトウェアは_、KD 値を持つヒルフィットプロットを生成します。ヒルフィットプロットは、分析物濃度の関数として、分析物と標的タンパク質との関連を記述します。最大応答の半分が達成される濃度は_、KD 値に比例する。低い_KD 値は高い結合親和性を表し、その逆も同様である。

FEB実験で得られたデータを検証するために、データレビュー/エクスポートソフトウェアを使用して、各分析物濃度の各読み出しポイントからI-Responseを抽出し、以下で説明するように他の統計分析ソフトウェア( 材料表を参照)にエクスポートすることができます。