Summary

استكشاف التفاعل الجزيئي الحيوي بين Molecular Chaperone Hsp90 وبروتين العميل Kinase Cdc37 باستخدام تقنية الاستشعار الحيوي ذات التأثير الميداني

Published: March 31, 2022
doi:

Summary

الاستشعار الحيوي للتأثير الميداني (FEB) هو تقنية خالية من الملصقات للكشف عن التفاعلات الجزيئية الحيوية. يقيس التيار الكهربائي من خلال المستشعر الحيوي للجرافين الذي يتم تجميد الأهداف الملزمة له. تم استخدام تقنية FEB لتقييم التفاعلات الجزيئية الحيوية بين Hsp90 و Cdc37 وتم اكتشاف تفاعل قوي بين البروتينين.

Abstract

تلعب التفاعلات الجزيئية الحيوية أدوارا متعددة الاستخدامات في العديد من العمليات الخلوية من خلال تنظيم وتنسيق الأحداث البيولوجية ذات الصلة وظيفيا. الجزيئات الحيوية مثل البروتينات والكربوهيدرات والفيتامينات والأحماض الدهنية والأحماض النووية والإنزيمات هي لبنات أساسية للكائنات الحية. يتجمعون في شبكات معقدة في الأنظمة الحيوية لمزامنة عدد لا يحصى من أحداث الحياة. تستخدم البروتينات عادة شبكات تفاعلية معقدة للقيام بوظائفها. وبالتالي ، من الضروري تقييم مثل هذه التفاعلات للكشف عن أهميتها في الخلايا على المستويين الخلوي والكائنات الحية. ولتحقيق هذا الهدف، نقدم تقنية ناشئة بسرعة، وهي الاستشعار البيولوجي للتأثير الميداني (FEB)، لتحديد التفاعلات الجزيئية الحيوية المحددة. FEB هي تقنية للكشف عن الجزيئات الحيوية على الطاولة وخالية من الملصقات وموثوقة لتحديد تفاعلات محددة وتستخدم أجهزة استشعار حيوية إلكترونية عالية الجودة. يمكن لتقنية FEB مراقبة التفاعلات في نطاق nanomolar بسبب المواد النانوية المتوافقة بيولوجيا المستخدمة على سطح المستشعر الحيوي. وكدليل على المفهوم، تم توضيح التفاعل بين البروتين والبروتين (PPI) بين بروتين الصدمة الحرارية 90 (Hsp90) ودورة انقسام الخلايا 37 (Cdc37). Hsp90 هو مرافقة جزيئية تعتمد على ATP تلعب دورا أساسيا في طي واستقرار ونضج ومراقبة جودة العديد من البروتينات ، وبالتالي تنظيم وظائف خلوية حيوية متعددة. يعتبر Cdc37 مرافقا جزيئيا خاصا بالبروتين كيناز ، لأنه يتعرف على وجه التحديد على كينازات البروتين ويجندها إلى Hsp90 لتنظيم مسارات نقل الإشارة في المصب. على هذا النحو ، يعتبر Cdc37 مرافقا مشاركا ل Hsp90. يتم تنشيط مسار كيناز المرافق (مجمع Hsp90 / Cdc37) بشكل مفرط في الأورام الخبيثة المتعددة التي تعزز النمو الخلوي. لذلك ، فهو هدف محتمل لعلاج السرطان. توضح هذه الدراسة كفاءة تقنية FEB باستخدام نظام النموذج Hsp90/Cdc37. اكتشف FEB مؤشر PPI قوي بين البروتينين (قيم KD من 0.014 ميكرومتر ، 0.053 ميكرومتر ، و 0.072 ميكرومتر في ثلاث تجارب مستقلة). باختصار ، FEB هي منصة للكشف عن PPI خالية من الملصقات وفعالة من حيث التكلفة ، والتي توفر قياسات سريعة ودقيقة.

Introduction

التفاعلات الجزيئية الحيوية:
البروتينات هي أجزاء أساسية من الكائنات الحية وتشارك في العديد من المسارات الجزيئية مثل استقلاب الخلية ، وبنية الخلية ، وإشارات الخلية ، والاستجابات المناعية ، والتصاق الخلايا ، وأكثر من ذلك. في حين أن بعض البروتينات تؤدي وظيفتها (وظائفها) بشكل مستقل ، فإن معظم البروتينات تتفاعل مع البروتينات الأخرى باستخدام واجهة ملزمة لتنسيق النشاط البيولوجي السليم1.

يمكن تصنيف التفاعلات الجزيئية الحيوية بشكل أساسي بناء على الخصائص الهيكلية والوظيفية المميزة للبروتينات المعنية2 ، على سبيل المثال ، بناء على أسطح البروتين أو الاستقرار المعقد أو استمرار التفاعلات3. يعد تحديد البروتينات الأساسية وأدوارها في التفاعلات الجزيئية الحيوية أمرا حيويا لفهم الآليات الكيميائية الحيوية على المستوى الجزيئي4. حاليا ، هناك طرق مختلفة للكشف عن هذه التفاعلات5: في المختبر6 ، في سيليكو7 ، في الخلايا الحية8 ، خارج الجسم الحي 9 ، وفي الجسم الحي10 مع كل منها نقاط القوة والضعف الخاصة بها.

يتم إجراء الفحوصات في الجسم الحي باستخدام الحيوان بأكمله كأداة تجريبية11 ، ويتم إجراء الفحوصاتخارج الجسم الحي على مستخلصات الأنسجة أو الأعضاء بأكملها (مثل القلب والدماغ والكبد) في بيئة خارجية خاضعة للرقابة من خلال توفير الحد الأدنى من التغييرات في الظروف الطبيعية. التطبيق الأكثر شيوعا للدراسات في الجسم الحي وخارج الجسم الحي هو تقييم الحرائك الدوائية والديناميكا الدوائية وآثار السمية للعوامل الدوائية المحتملة قبل التجارب البشرية من خلال ضمان سلامتها وفعاليتها بشكل عام12.

يمكن أيضا اكتشاف التفاعلات الجزيئية الحيوية داخل الخلايا الحية. يسمح لنا تصوير الخلايا الحية بمراقبة التفاعلات الديناميكية أثناء تنفيذها لتفاعلات مسار كيميائي حيوي معين13. علاوة على ذلك ، يمكن أن توفر تقنيات الكشف ، مثل التلألؤ الحيوي أو نقل طاقة الرنين الفلوري ، معلومات حول مكان وزمان حدوث هذه التفاعلات داخل الخلية14. على الرغم من أن الكشف في الخلايا الحية يقدم تفاصيل حاسمة ، إلا أن منهجيات الكشف هذه تعتمد على البصريات والتسميات ، والتي قد لا تعكس البيولوجيا الأصلية. كما أنها أقل تحكما من الطرق المخبرية وتتطلب خبرة متخصصة لأداء15.

تستخدم الطرق الحسابية في سيليكو في المقام الأول للفحص على نطاق واسع للجزيئات المستهدفة قبل التجارب في المختبر . طرق التنبؤ الحسابي ، وقواعد البيانات القائمة على الكمبيوتر ، والالتحام الجزيئي ، والعلاقات بين البنية الكمية والنشاط ، وغيرها من أساليب محاكاة الديناميكا الجزيئية هي من بين الراسخة في أدوات silico 16. بالمقارنة مع التقنيات التجريبية الشاقة ، يمكن لأدوات silico بسهولة إجراء تنبؤات بحساسية عالية ، ولكن مع دقة منخفضة في الأداء التنبؤي17.

يتم إجراء الفحوصات في المختبر مع الكائنات الحية الدقيقة أو الجزيئات البيولوجية خارج سياقها البيولوجي القياسي. يعد تصوير التفاعلات الجزيئية الحيوية من خلال الطرق المخبرية أمرا بالغ الأهمية لفهم وظائف البروتين والبيولوجيا الكامنة وراء الشبكة المعقدة لعمل الخلايا. يتم اختيار منهجية الفحص المفضلة وفقا للخصائص الجوهرية للبروتين والقيم الحركية وطريقة وشدة التفاعلات18,19.

تفاعل Hsp90/Cdc37:
يعد مسار المرافق-كيناز ، الذي يربط بين Hsp90 و Cdc37 ، هدفا علاجيا واعدا في بيولوجيا الورم20. يلعب Hsp90 دورا مركزيا في التحكم في دورة الخلية ، وتجميع البروتين ، وبقاء الخلية ، ومسارات الإشارات. يتم تسليم البروتينات التي تعتمد على Hsp90 لوظائفها إلى Hsp90 للتعقيد من خلال مرافق مشارك ، مثل Cdc37. يتحكم مركب Hsp90 / Cdc37 في طي معظم كينازات البروتين ويعمل كمركز للعديد من شبكات الإشارات داخل الخلايا21. وهو هدف واعد مضاد للورم بسبب تعبيره المرتفع في الأورام الخبيثة المختلفة ، بما في ذلك سرطان الدم النقوي الحاد ، والورم النقوي المتعدد ، وسرطان الخلايا الكبدية22,23.

يشيع استخدامها في تقنيات الكشف عن التفاعل الجزيئي الحيوي في المختبر
الترسيب المناعي المشترك (co-IP) هو تقنية تعتمد على خصوصية الأجسام المضادة المستضدية لتحديد التفاعلات ذات الصلة بيولوجيا24. العيب الأساسي لهذه الطريقة هو عدم قدرتها على اكتشاف التفاعلات منخفضة التقارب والقيم الحركية24. ويفضل اتباع طرق فيزيائية حيوية مثل قياس كالوريمتر المعايرة بالتحليل الحجمي متساوي الحرارة (ITC)، ورنين البلازمون السطحي (SPR)، وقياس تداخل الطبقة الحيوية (BLI)، وتكنولوجيا FEB لتحديد القيم الحركية.

ITC هي طريقة للكشف البيوفيزيائي تعتمد على تحديد طاقة الربط جنبا إلى جنب مع تحليل الديناميكا الحرارية الكامل لتوصيف التفاعلات الجزيئية الحيوية25. الميزة الأساسية ل ITC هي أنه لا يتطلب أي وضع علامات أو تثبيت للبروتين المستهدف. الصعوبات الرئيسية التي يواجهها مركز التجارة الدولية هي التركيز العالي للبروتين المستهدف المطلوب لتجربة واحدة وصعوبة تحليل المجمعات غير التساهمية بسبب المحتوى الحراري الصغير المرتبط26. كل من SPR و BLI هما تقنيتان بيوفيزيائيتان خاليتان من الملصقات تعتمدان على تجميد الجزيء المستهدف على سطح المستشعر ، تليها حقن لاحقة للتحليل فوق الهدفالمعطل 27,28. في SPR ، يتم قياس التغيرات في معامل الانكسار أثناء التفاعلات الجزيئية الحيوية27 ؛ في BLI، يتم تسجيل التداخل في الضوء المنعكس في الوقت الحقيقي كتغيير في الطول الموجي كدالة للوقت28. يشترك كل من SPR و BLI في مزايا مشتركة تتمثل في تقديم قدرات عالية من حيث الخصوصية والحساسية والكشف29. في كلتا الطريقتين ، يتم تجميد البروتين المستهدف على أسطح أجهزة الاستشعار الحيوية ، وبالتالي ، قد يكون هناك بعض الفقدان للتشكيل الأصلي للهدف ، مما يجعل من الصعب التمييز بين التفاعلات المحددة مقابل التفاعلات غير المحددة30. يستخدم BLI أجهزة استشعار حيوية باهظة الثمن من الألياف البصرية يمكن التخلص منها لشل حركة الهدف ، وبالتالي فهي تقنية مكلفة31. بالمقارنة مع أدوات الكشف الجزيئي الحيوي الراسخة هذه ، توفر تقنية FEB منصة موثوقة وخالية من الملصقات باستخدام تركيزات نانومولية منخفضة للكشف عن الجزيئات الحيوية في الوقت الفعلي مع التوصيف الحركي. تتغلب تقنية FEB أيضا على التحديات الفقاعية التي تواجهها ITC وهي أكثر فعالية من حيث التكلفة مقارنة ب SPR أو BLI.

تعد المستشعرات الحيوية القائمة على الترانزستور ذو التأثير الميداني (FET) مجالا ناشئا للكشف عن التفاعلات الجزيئية الحيوية من خلال تقديم تطبيقات طبية حيوية متنوعة. في نظام FET ، يتم تجميد الأهداف إلى رقائق الاستشعار الحيوي ويتم الكشف عن التفاعلات من خلال التغييرات في التوصيل32. الميزة الفريدة التي يجب مراعاتها في تطوير مستشعر حيوي إلكتروني فعال هي الخصائص الفيزيائية والكيميائية مثل الطبيعة شبه الموصلة والاستقرار الكيميائي لمواد الطلاء المستخدمة في تصنيع سطح المستشعر33. المواد التقليدية مثل السيليكون المستخدمة في FET حدت من حساسية أجهزة الاستشعار لأنها تتطلب طبقات أكسيد محصورة بين قناة الترانزستور وبيئة محددة للعمل السليم34. علاوة على ذلك ، فإن ترانزستورات السيليكون حساسة للبيئات عالية الملح ، مما يجعل من الصعب قياس التفاعلات البيولوجية في بيئتها الطبيعية. يتم تقديم المستشعر الحيوي القائم على الجرافين كبديل لأنه يوفر استقرارا كيميائيا ممتازا ومجالا كهربائيا. نظرا لأن الجرافين عبارة عن طبقة ذرية واحدة من الكربون ، فهو حساس للغاية كأشباه موصلات ومتوافق كيميائيا مع المحاليل البيولوجية. كل من هذه الصفات مرغوب فيها لإنشاء أجهزة استشعار حيوية إلكترونية متوافقة35. تؤدي إمكانات التحميل العالية للغاية للجزيئات الحيوية التي توفرها أجهزة الاستشعار الحيوية المغلفة بالجرافين إلى تطوير تقنية FEB لأجهزة الاستشعار الحيوية القائمة على الجرافين.

مبدأ تقنية FEB: FEB هي تقنية للكشف الجزيئي الحيوي خالية من الملصقات تقيس التيار الكهربائي من خلال مستشعر الجرافين الحيوي الذي يتم تجميد الأهداف الملزمة له. تؤدي التفاعلات بين البروتين المثبت والتحليل إلى تغيرات في التيار يتم رصدها في الوقت الفعلي ، مما يتيح قياسات حركية دقيقة36.

الأجهزة: يتكون نظام FEB من شريحة مستشعر الترانزستور ذات التأثير الميداني للجرافين (gFET) وقارئ إلكتروني يطبق جهدا ثابتا طوال التجربة (الشكل 1). يتم تطبيق التحليل في محلول على البروتين المستهدف المثبت على سطح المستشعر الحيوي. عند حدوث تفاعل ، يتم قياس تغيير في التيار وتسجيله في الوقت الفعلي. مع زيادة تركيز التحليل ، سيزداد أيضا جزء التحليل المرتبط ، مما يتسبب في حدوث تناوب أعلى في التيار. باستخدام برنامج التحليل الآلي المزود بالأداة (جدول المواد) ، يتم قياس I-Response وتسجيله من حيث وحدات الاستشعار البيولوجي (BU)37. يتم تعريف I-Response على أنه التغيير في التيار (I) من خلال شريحة المستشعر الحيوي التي يتم قياسها في الوقت الفعلي عند تفاعل الهدف المثبت مع التحليل. يمكن لبرنامج التحليل الآلي FEB تحليل كل من I-Response و C-Response لأحداث التفاعل الديناميكي ، حيث يسجل C-Response التغييرات في السعة (C). تتوافق الاختلافات في كل من I-Response و C-Response مباشرة مع جزء التحليل المرتبط ويمكن تحليلها بشكل أكبرلإنشاء قيم K D. التفضيل الافتراضي لبرنامج التحليل الآلي هو I-Response.

Figure 1
الشكل 1: نظرة عامة على الإعداد التجريبي . (أ) رقاقة قائمة على الجرافين وقارئ إلكتروني. (ب) نظرة عامة على مكونات الشريحة. يتم توصيل الشريحة بقطبين كهربائيين يزودان النظام بالتيار الكهربائي. سطح الشريحة مغطى بالجرافين ، والذي عند تنشيطه يمكن أن يربط الهدف. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

منهج:
في البداية ، يتم إدخال شريحة المستشعر الحيوي المنشطة في جهاز FEB (الشكل 1) متبوعا بتنفيذ الخطوات الموضحة أدناه: (1) المعايرة: تبدأ التجربة بمعايرة النظام باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x (PBS ؛ الرقم الهيدروجيني = 7.4) لإنشاء استجابة توازن خط الأساس. (2) الاقتران: يتم إدخال التحليل في الشريحة ، ويتم مراقبة I-Response حتى يتم الوصول إلى تشبع الربط. (3) الانفصال: يتم فصل التحليل باستخدام 1x PBS. (4) التجديد: تتم إزالة بقايا التحليل باستخدام 1x PBS. (5) الغسيل: يتم إجراء ما مجموعه خمس غسلات باستخدام 1x PBS لإزالة التحليلات المربوطة وغير المربوطة من الشريحة بشكل شامل.

تحليل:
يتم إجراء تحليل البيانات باستخدام البرنامج الآلي بالكامل المقدم مع الأداة. يقوم برنامج التحليل الآلي بإنشاء قطعة أرض مناسبة لHill بقيمة K D. تصف مؤامرة هيل فيت ارتباط التحليل بالبروتين المستهدف كدالة لتركيزات التحليل. يتناسب التركيز الذي يتم فيه تحقيق استجابة نصف قصوىمع قيمة K D. تمثل قيمة KD المنخفضة تقاربا عاليا للربط والعكس صحيح.

للتحقق من صحة البيانات التي تم الحصول عليها من تجربة FEB ، يتم استخراج I-Responses من كل نقطة قراءة لكل تركيز تحليلي باستخدام برنامج مراجعة / تصدير البيانات ويمكن تصديرها إلى برامج التحليل الإحصائي الأخرى (انظر جدول المواد) كما هو موضح أدناه.

Protocol

ملاحظة: تم الحصول على البروتينات المؤتلفة المستخدمة في هذه الدراسة، Hsp90 و Cdc37، تجاريا (انظر جدول المواد). 1. تنشيط الشريحة ملاحظة: يتم سرد جميع المواد التي سيتم استخدامها في التجربة في جدول المواد. قم بتصفية جميع المحاليل المحضرة من خل…

Representative Results

نتائج التجربة 1:تم تجميد البروتين المستهدف Hsp90 (500 نانومتر) إلى الشريحة باتباع بروتوكول تثبيت الهدف كما هو موضح أعلاه. بالنسبة للتجربة الأولى ، تم إعداد 10 تركيزات من البروتين التحليلي ، Cdc37 ، تتراوح من 25 نانومتر إلى 5000 نانومتر ، بناء على البيانات المتاحة في الأدبيات (انظر الجد…

Discussion

في هذه الدراسة ، تم تقييم جدوى استخدام تقنية FEB (نهج توصيف حركي في الوقت الفعلي) لتحديد التفاعل الجزيئي الحيوي بين Hsp90 و Cdc37. اقترحت التجربة الاستكشافية الأولية (التجربة الأولى) أن اختيار تركيزات التحليل المناسبة هو جزء حاسم من التجربة وأنه ينبغي تصميم التجربة من خلال تضمين نقاط تركيز أعلى و…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم دعم هذا البحث من خلال منحة من مؤسسة العلوم ثنائية القومية (BSF) إلى S.K.S. و N.Q.

Materials

Automated analysis software Agile plus software, Cardea (Nanomed) NA
CAS number: NA
Referred to in the text as the automated analysis software supplied with the instrument. Generates automated analysis.
COOH-BPU (Biosensing Processing Unit) Agile plus software, Cardea (Nanomed) NA
CAS number: NA
biosensor chip
Data review software Datalign 1.0, Cardea (Nanomed) NA
CAS number: NA
Referred to as the supplied data review software in the text. Supplied with the instrument and allows to review and export the information data points.
Dialysis bag CelluSep,  Membrane filtration products T2-10-15
CAS number: NA
T2 tubings (6,000-8,000 MWCO), (10 mm fw, 6.4mm Ø, 0.32ml/cm, 15m)
EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylamino propyl) carbodiimide) Cardea (Nanomed) EDC160322-02
CAS number: 25952-53-8
White powder
ITC (Isothermal titration calorimetry) system Microcal-PEAQ-ITC (Malvern, United Kingdom) NA
CAS number: NA
MES (2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid) buffer Merck M3671-50G
CAS number: 4432-31-9
White powder
NHS (N-Hydroxysulfosuccinimide) chips Cardea (Nanomed) NA
CAS number: NA
Graphene-based chip
PBS (Phosphate-buffered saline) X 10 Bio-Lab 001623237500 
CAS number: 7758-11-4
Liquid transparent solution
Pipete Thermo Scientific 11855231
CAS number: NA
Finnpipette F3 5-50 µL, yellow
Quench 1 (3.9 mM amino-PEG5-alcohol in 1 X PBS) Cardea (Nanomed) 0105-001-002-001
CAS number: NA
Liquid, transparent solution
Quench 2 (1 M ethanolamine (pH=8.5)) Cardea (Nanomed) 0105-001-003-001
CAS number: NA
Liquid, transparent solution
Recombinant protein Cdc37 Abcam ab256157
CAS number: NA
Recombinant protein Hsp90 beta Abcam ab80033
CAS number: NA
Spreadsheet Excel, Microsoft office NA
CAS number: NA
Statistical software GraphPad, Prism NA
CAS number: NA
Referred to as the other statistical software. Sigma plot, phyton or other statistical programes may also be used
Sulfo-NHS Cardea (Nanomed) NHS160321-07
CAS number: 106627-54-7
White powder
Tips Alex red LC 1093-800-000
CAS number: NA
Tip 1-200 µl, in bulk, 1,000 pcs

References

  1. Tuncbag, N., Gursoy, A., Guney, E., Nussinov, R., Keskin, O. Architectures and functional coverage of protein-protein interfaces. Journal of Molecular Biology. 381 (3), 785-802 (2008).
  2. Berggård, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein–protein interactions. Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).
  3. Magliery, T. J., et al. Detecting protein-protein interactions with a green fluorescent protein fragment reassembly trap: Scope and mechanism. Journal of the American Chemical Society. 127 (1), 146-157 (2005).
  4. Xing, S., Wallmeroth, N., Berendzen, K. W., Grefen, C. Techniques for the analysis of protein-protein interactions in vivo. Plant Physiology. 171 (2), 727-758 (2016).
  5. Nguyen, T. N., Goodrich, J. A. Protein-protein interaction assays: Eliminating false positive interactions. Nature Methods. 3 (2), 135-139 (2006).
  6. Fernández-Suárez, M., Chen, T. S., Ting, A. Y. Protein-protein interaction detection in vitro and in cells by proximity biotinylation. Journal of the American Chemical Society. 130 (29), 9251-9253 (2008).
  7. Jiang, M., Niu, C., Cao, J., Ni, D. -. A., Chu, Z. In silico-prediction of protein–protein interactions network about MAPKs and PP2Cs reveals a novel docking site variants in Brachypodium distachyon. Scientific Reports. 8 (1), 15083 (2018).
  8. Yazawa, M., Sadaghiani, A. M., Hsueh, B., Dolmetsch, R. E. Induction of protein-protein interactions in live cells using light. Nature Biotechnology. 27 (10), 941-945 (2009).
  9. Wang, W., Goodman, M. T. Antioxidant property of dietary phenolic agents in a human LDL-oxidation ex vivo model: Interaction of protein binding activity. Nutrition Research. 19 (2), 191-202 (1999).
  10. Xing, S., Wallmeroth, N., Berendzen, K. W., Grefen, C. Techniques for the analysis of protein-protein interactions in vivo. Plant Physiology. 171 (2), 727-758 (2016).
  11. Qvit, N., Disatnik, M. -. H., Sho, E., Mochly-Rosen, D. Selective phosphorylation inhibitor of delta protein kinase C–Pyruvate dehydrogenase kinase protein–protein interactions: Application for myocardial injury in vivo. Journal of the American Chemical Society. 138 (24), 7626-7635 (2016).
  12. Alam, M. N., Bristi, N. J., Rafiquzzaman, M. Review on in vivo and in vitro methods evaluation of antioxidant activity. Saudi Pharmaceutical Journal. 21 (2), 143-152 (2013).
  13. Paulmurugan, R., Gambhir, S. S. Novel fusion protein approach for efficient high-throughput screening of small molecule–mediating protein-protein interactions in cells and living animals. Recherche en cancérologie. 65 (16), 7413-7420 (2005).
  14. Boute, N., Jockers, R., Issad, T. The use of resonance energy transfer in high-throughput screening: BRET versus FRET. Trends in Pharmacological Sciences. 23 (8), 351-354 (2002).
  15. Deriziotis, P., Graham, S. A., Estruch, S. B., Fisher, S. E. Investigating protein-protein interactions in live cells using bioluminescence resonance energy transfer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), e51438 (2014).
  16. Ekins, S., Mestres, J., Testa, B. In silico pharmacology for drug discovery: Methods for virtual ligand screening and profiling. British Journal of Pharmacology. 152 (1), 9-20 (2007).
  17. Valerio, L. G. Application of advanced in silico methods for predictive modeling and information integration. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 8 (4), 395-398 (2012).
  18. Piehler, J. New methodologies for measuring protein interactions in vivo and in vitro. Current Opinion in Structural Biology. 15 (1), 4-14 (2005).
  19. Ideker, T., Sharan, R. Protein networks in disease. Genome Research. 18 (4), 644-652 (2008).
  20. Lu, H., et al. Recent advances in the development of protein–protein interactions modulators: mechanisms and clinical trials. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 213 (2020).
  21. Jarosz, D. Hsp90: A global regulator of the genotype-to-phenotype map in cancers. Advances in Cancer Research. 129, 225-247 (2016).
  22. Johnson, V. A., Singh, E. K., Nazarova, L. A., Alexander, L. D., McAlpine, S. R. Macrocyclic inhibitors of Hsp90. Current Topics in Medicinal Chemistry. 10 (14), 1380-1402 (2010).
  23. Mahalingam, D., et al. Targeting HSP90 for cancer therapy. British Journal of Cancer. 100 (10), 1523-1529 (2009).
  24. Stewart, A., Fisher, R. A. Co-Immunoprecipitation: Isolation of protein signaling complexes from native tissues. Methods in Cell Biology. 112, 33-54 (2012).
  25. Pierce, M. M., Raman, C. S., Nall, B. T. Isothermal titration calorimetry of protein-protein interactions. Methods. 19 (2), 213-221 (1999).
  26. Paketurytė, V., et al. Inhibitor binding to carbonic anhydrases by isothermal titration calorimetry. Carbonic Anhydrase as Drug Target. , 79-95 (2019).
  27. Grote, J., Dankbar, N., Gedig, E., Koenig, S. Surface plasmon resonance/mass spectrometry interface. Analytical Chemistry. 77 (4), 1157-1162 (2005).
  28. Kumaraswamy, S., Tobias, R. Label-free kinetic analysis of an antibody–antigen interaction using biolayer interferometry. Methods in Molecular Biology. , 165-182 (2015).
  29. Wallner, J., Lhota, G., Jeschek, D., Mader, A., Vorauer-Uhl, K. Application of bio-layer interferometry for the analysis of protein/liposome interactions. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 72, 150-154 (2013).
  30. Singh, A. N., Ramadan, K., Singh, S. Experimental methods to study the kinetics of protein–protein interactions. Advances in Protein Molecular and Structural Biology Methods. , 115-124 (2022).
  31. Frenzel, D., Willbold, D. Kinetic titration series with biolayer interferometry. PLoS One. 9 (9), 106882 (2014).
  32. Vu, C. -. A., Chen, W. -. Y. Field-effect transistor biosensors for biomedical applications: Recent advances and future prospects. Sensors. 19 (19), 4214 (2019).
  33. Bergveld, P. A critical evaluation of direct electrical protein detection methods. Biosensors & Bioelectronics. 6 (1), 55-72 (1991).
  34. Lowe, B. M., Sun, K., Zeimpekis, I., Skylaris, C. K., Green, N. G. Field-effect sensors – from pH sensing to biosensing: sensitivity enhancement using streptavidin–biotin as a model system. The Analyst. 142 (22), 4173-4200 (2017).
  35. Goldsmith, B. R., et al. Digital biosensing by foundry-fabricated graphene sensors. Scientific Reports. 9 (1), 434 (2019).
  36. Afsahi, S., et al. Novel graphene-based biosensor for early detection of Zika virus infection. Biosensors and Bioelectronics. 100, 85-88 (2018).
  37. Afsahi, S. J., et al. Towards novel graphene-enabled diagnostic assays with improved signal-to-noise ratio. MRS Advances. 2 (60), 3733-3739 (2017).
  38. Roe, S. M., et al. The mechanism of Hsp90 regulation by the protein kinase-specific cochaperone p50cdc37. Cell. 116 (1), 87-98 (2004).
  39. Gaiser, A. M., Kretzschmar, A., Richter, K. Cdc37-Hsp90 complexes are responsive to nucleotide-induced conformational changes and binding of further cofactors. The Journal of Biological Chemistry. 285 (52), 40921-40932 (2010).
  40. Popescu, A. I., Găzdaru, D. M., Chilom, C. G., Bacalum, M. Biophysical interactions: Their paramount importance for life. Romanian Reports in Physics. 65 (3), 1063-1077 (2013).
  41. Surya, S., Abhilash, J., Geethanandan, K., Sadasivan, C., Haridas, M. A profile of protein-protein interaction: Crystal structure of a lectin-lectin complex. International Journal of Biological Macromolecules. 87, 529-536 (2016).
  42. Velazquez-Campoy, A., Freire, E. ITC in the post-genomic era…? Priceless. Biophysical Chemistry. 115 (23), 115-124 (2005).
  43. Concepcion, J., et al. Label-free detection of biomolecular interactions using bioLayer interferometry for kinetic characterization. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 12 (8), 791-800 (2009).
  44. Helmerhorst, E., Chandler, D. J., Nussio, M., Mamotte, C. D. Real-time and label-free bio-sensing of molecular interactions by surface plasmon resonance: A laboratory medicine perspective. The Clinical Biochemist. Reviews. 33 (4), 161-173 (2012).
  45. Jacob, N. T., et al. Synthetic molecules for disruption of the MYC protein-protein interface. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 26 (14), 4234-4239 (2018).

Play Video

Citer Cet Article
Lerner, Y., Sukumaran, S., Chua, M., So, S. K., Qvit, N. Exploring Biomolecular Interaction Between the Molecular Chaperone Hsp90 and Its Client Protein Kinase Cdc37 using Field-Effect Biosensing Technology. J. Vis. Exp. (181), e63495, doi:10.3791/63495 (2022).

View Video