Summary

マウスのCisterna Magna を介して 尾側脳幹および上部頸椎脊髄をマイクロインジェクションする定位的外科的アプローチ

Published: January 21, 2022
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Summary

マウスの脳部位を標的とする定位手術は、一般に頭蓋骨を介したアクセスを含み、頭蓋骨のランドマークによって導かれる。ここでは、脳幹のランドマークの直接可視化に依存する大槽 マグナを介して 尾側脳幹と上部頸部脊髄を標的とする代替定位アプローチを概説する。

Abstract

マウスの脳部位を標的とする定位手術は、一般的に頭蓋骨のランドマークによって導かれる。その後、頭蓋骨に穴を開けたバリ穴 を介して アクセスが得られます。この標準的なアプローチは、尾側脳幹および上部頸椎帯の標的にとって、これらの部位が頭蓋骨のランドマークから遠く離れているため、特定の解剖学的課題のために困難であり、不正確さにつながる可能性がある。ここでは、尾側脳幹および上部頸椎の関心のある離散領域を標的とするために使用される、大槽を介した代替定位アプローチ 概説する。大槽マグナは後頭骨からアトラス(すなわち、第2の椎骨)まで延びており、脳脊髄液で満たされ、硬膜で覆われている。このアプローチは、解剖学的障壁のために到達しにくい選択された中枢神経系(CNS)構造への再現可能なアクセス経路を提供する。さらに、標的部位に近接した脳幹ランドマークを直接可視化することができ、尾側脳幹および上部頸部の限られた関心領域に少量の注射を送達する場合の精度が向上する。最後に、このアプローチは、運動および感覚運動研究にとって重要な小脳を回避する機会を提供する。

Introduction

マウス1の脳部位を標的とする標準的な定位手術は、一般に、一組のイヤーバーおよびマウスバーを用いた頭蓋骨の固定を含む。座標は、次に、参照アトラス2,3、および頭蓋骨のランドマーク、すなわちブレグマ(前頭骨と頭頂骨の縫合糸が一緒になる点)またはラムダ(頭頂骨と後頭骨の縫合糸が一緒になる点;図1A、B)。推定された標的の上の頭蓋骨へのバリ穴を通して、マイクロインジェクションの送達またはカニューレまたは光ファイバーによる器具付けのいずれかのために、標的領域に到達することができる。これらの縫合糸の解剖学的構造の変化およびブレグマまたはラムダ4,5の局在化における誤りのために、脳に対するゼロ点の位置は動物によって異なる。この変動から生じるターゲティングの小さな誤差は、大規模または近くのターゲットにとっては問題ではないが、前後または背側房面のゼロ点から離れた小さな関心領域、および/または年齢、緊張および/または性別によってサイズが変化する動物を研究する場合、その影響は大きい。延髄と上部頸髄に特有のいくつかの追加の課題があります。第1に、前後座標の小さな変化は、小脳の位置および形状に起因する硬膜に対する背腹座標の有意な変化と関連している(図1Bi)2,6,7第2に、上部頸帯は頭蓋骨2内には含まれない。第三に、後頭骨の傾斜位置と頸部筋肉2の層が傾いているため、脳幹と脊髄の移行部付近に位置する構造では、標準的な定位アプローチがさらに困難になります(図1Bi)。最後に、尾側脳幹および頸部コードにおいて関心のある多くの標的は小さく2であり、正確で再現性のある注射を必要とする8,9

貯水槽マグナを通る代替アプローチは、これらの問題を回避します。水槽マグナは、後頭骨からアトラス(図1A、すなわち、第2の椎骨)10まで延びる大きな空間である。それは脳脊髄液で満たされ、硬膜10によって覆われている。後頭骨とアトラスの間のこの空間は、頭部を前屈させるときに開く。これは、縦頭蓋筋の上にある対になった腹の間を移動し、尾側脳幹の背側表面を露出させることによってアクセスすることができる。関心のある領域は、背側表面の近くにある場合、これらの領域自体のランドマークに基づいてターゲットにすることができます。または、中心運河がIV心室に開く点であるobexを、座標がより深い構造に到達するためのゼロ点として使用することによって。このアプローチは、腹側呼吸器群、髄内側網状形成、孤独路の核、領域後脳、または舌下核を標的とするラット11、ネコ12、マウス89、および非ヒト霊長類13を含む様々な種において首尾よく使用されている。しかし、このアプローチは、解剖学の知識、特殊なツールキット、および標準的な定位アプローチと比較してより高度な手術スキルを必要とするため、広く利用されていません。

ここでは、大槽 マグナを介して 脳幹と上部頸髄に到達し、ランドマークを視覚化し、ゼロ点を設定し(図2)、関心のある個別の脳幹および脊髄領域へのマイクロインジェクションの定位送達のためのターゲット座標を推定および最適化するための段階的な外科的アプローチについて説明します(図3)。次に、このアプローチに関連する長所と短所について説明します。

Protocol

著者は、プロトコルがベスイスラエルディーコネス医療センターの施設動物ケアおよび使用委員会のガイドラインに従っていると宣言しています。 1. 手術器具・定位フレームの作製 注:手術は無菌条件下で行われます。無菌性は、無菌チップ技術を用いて維持される。 選択した注射剤(アデノ随伴ウイルス(AAV)または従来のトレー?…

Representative Results

水槽マグナアプローチは、標準的な定位アプローチでは到達しにくい、または一貫性のない標的化を起こしやすい尾側脳幹および上部頸索構造を標的にすることを可能にする。大槽に到達するための手術は、皮膚の切開、トラペジウス筋の薄い層、および硬膜の開口部を必要とし、したがってマウスによって十分に許容される。これは、標準的な定位アプローチのように複数のバリ穴?…

Discussion

標準的な定位手術は、CNS1の標的部位の座標を計算するために、一般的に頭蓋骨のランドマークに依存している。その後、標的部位は、頭蓋骨1にドリルで開けられたバリ穴を介してアクセスされる。この方法は、標的部位が前後面および背側腹面2の頭蓋骨ランドマークから遠くに位置し、頭蓋骨の解剖学的構造および上層筋肉がア?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作業は、R01 NS079623、P01 HL149630、および P01 HL095491 によってサポートされました。

Materials

Alcohol pad Med-Vet International SKU: MDS090735Z skin preparation for the prevention of surgical site infection
Angled forceps, Dumont #5/45 FST 11251-35 only to grab dura
Betadine pad Med-Vet International SKU:PVP-PAD skin preparation for the prevention of surgical site infection
Cholera toxin subunit-b, Alexa Fluor 488/594 conjugate Thermo Fisher Scientific 488: C34775, 594: C22842 Fluorescent tracer
Clippers Wahl Model MC3, 28915-10 for shaving fur at surgical site
Electrode holder with corner clamp Kopf 1770 to hold glass pipette
Flowmeter Gilmont instruments model # 65 MM to regulate flow of isoflurane and oxygen to mouse on the surgical plane
Fluorescent microspheres, polystyrene Thermo Fisher Scientific F13080 Fluorescent tracer
Heating pad Stoelting 53800M thermoregulation
Induction chamber with port hook up kit Midmark Inc 93805107 92800131 chamber providing initial anasthesia
Insulin Syringe Exelint International 26028 to administer saline and analgesic
Isoflurane Med-Vet International SKU:RXISO-250 inhalant anesthetic
Isoflurane Matrix VIP 3000 vaporizer Midmark Inc 91305430 apparatus for inhalant anesthetic delivery
Laminectomy forceps, Dumont #2 FST 11223-20 only to clean dura
Medical air, compressed Linde UN 1002 used with stimulator & PicoPump for providing air for precision solution injection
Meloxicam SR Zoo Pharm LLC Lot # MSR2-211201 analgesic
Microhematocrit borosilicate glass pre calibrated capillary tube Globe Scientific Inc 51628 for transfection of material to designated co-ordinates
Mouse adaptor Stoelting 0051625  adapting rat stereotaxic frame for mouse surgery
Needle holder, Student Halsted- Mosquito Hemostats FST 91308-12 for suturing
Oxygen regulator Life Support Products S/N 909328, lot 092109 regulate oxygen levels from oxygen tank
Oxygen tank, compressed Linde USP UN 1072 provided along with isoflurane anasthesia
Plastic card not applicable not applicable any firm plastic card, cut to fit the stereotactic frame (e.g. ID card)
Pneumatic PicoPump ( or similar) World Precision Instruments (WPI) SYS-PV820 For precision solution injection
Saline, sterile Mountainside Medical Equipment H04888-10 to replace body fluids lost during surgery
Scalpel handle, #3 FST 10003-12 to hold scalpel
Scissors, Wagner FST 14070-12 to cut polypropylene suture
Spring scissors, Vannas 2.5mm with accompanying box FST 15002-08 scissors only to open dura, box to elevate body
Stereotactic micromanipulator Kopf 1760-61 attached to electrode holder to adjust position based on co-ordinates
Stereotactic 'U' frame assembly and intracellular base plate Kopf 1730-B, 1711 frame for surgery
Sterile cotton tipped applicators Puritan 25-806 10WC absorbing blood from surgical field
Sterile non-fenestrated drapes Henry Schein 9004686 for sterile surgical field
Sterile opthalmic ointment Puralube P1490 ocular lubricant
Stimulator & Tubing Grass Medical Instruments S44 to provide controlled presurred air for precision solution injection
Surgical Blade #10 Med-Vet International SKU: 10SS for skin incision
Surgical forceps, Extra fine Graefe FST 11153-10 to hold skin
Surgical gloves Med-Vet International MSG2280Z for asceptic surgery
Surgical microscope Leica Model M320/ F12 for 5X-40X magnification of surgical site
Suture 5-0 polypropylene Oasis MV-8661 to close the skin
Tegaderm 3M 3M ID 70200749250 provides sterile barrier
Universal Clamp and stand post Kopf 1725 attached to stereotactic U frame and intracellular base plate
Wound hook with hartman hemostats FST 18200-09, 13003-10 to separate muscles and provide surgical window

References

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Citer Cet Article
Joshi, K., Kirby, A., Niu, J., VanderHorst, V. Stereotaxic Surgical Approach to Microinject the Caudal Brainstem and Upper Cervical Spinal Cord via the Cisterna Magna in Mice. J. Vis. Exp. (179), e63344, doi:10.3791/63344 (2022).

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