Summary

Approccio chirurgico stereotassico per microiniettare il tronco encefalico caudale e il midollo spinale cervicale superiore tramite la Cisterna Magna nei topi

Published: January 21, 2022
doi:

Summary

La chirurgia stereotassica per colpire i siti cerebrali nei topi comporta comunemente l’accesso attraverso le ossa del cranio ed è guidata da punti di riferimento del cranio. Qui delineiamo un approccio stereotassico alternativo per colpire il tronco cerebrale caudale e il midollo spinale cervicale superiore attraverso la cisterna magna che si basa sulla visualizzazione diretta dei punti di riferimento del tronco cerebrale.

Abstract

La chirurgia stereotassica per colpire i siti cerebrali nei topi è comunemente guidata da punti di riferimento del cranio. L’accesso è quindi ottenuto tramite fori di bava praticati attraverso il cranio. Questo approccio standard può essere difficile per gli obiettivi nel tronco cerebrale caudale e nel cordone cervicale superiore a causa di specifiche sfide anatomiche in quanto questi siti sono lontani dai punti di riferimento del cranio, portando all’imprecisione. Qui delineiamo un approccio stereotassico alternativo tramite la cisterna magna che è stato utilizzato per indirizzare regioni discrete di interesse nel tronco cerebrale caudale e nel cordone cervicale superiore. La cisterna magna si estende dall’osso occipitale all’atlante (cioè il secondo osso vertebrale), è piena di liquido cerebrospinale ed è ricoperta da dura madre. Questo approccio fornisce una via di accesso riproducibile a strutture selezionate del sistema nervoso centrale (SNC) che sono altrimenti difficili da raggiungere a causa delle barriere anatomiche. Inoltre, consente la visualizzazione diretta dei punti di riferimento del tronco cerebrale in prossimità dei siti target, aumentando la precisione quando si erogano piccoli volumi di iniezione a regioni ristrette di interesse nel tronco cerebrale caudale e nel midollo cervicale superiore. Infine, questo approccio offre l’opportunità di evitare il cervelletto, che può essere importante per gli studi motori e sensomotori.

Introduction

La chirurgia stereotassica standard per colpire i siti cerebrali nei topi1 comporta comunemente la fissazione del cranio utilizzando una serie di barre auricolari e una barra della bocca. Le coordinate vengono quindi stimate in base agli atlantidi riferimento 2,3 e ai punti di riferimento del cranio, vale a dire, bregma (il punto in cui le suture delle ossa frontali e parietali si uniscono) o lambda (il punto in cui le suture delle ossa parietale e occipitale si uniscono; Figura 1A,B). Attraverso un foro di bava nel cranio sopra il bersaglio stimato, la regione target può quindi essere raggiunta, sia per la consegna di microiniezioni che per la strumentazione con cannule o fibre ottiche. A causa della variazione nell’anatomia di queste suture e degli errori nella localizzazione di bregma o lambda 4,5, la posizione dei punti zero in relazione al cervello varia da animale ad animale. Mentre piccoli errori nel targeting, che derivano da questa variabilità, non sono un problema per bersagli grandi o vicini, il loro impatto è maggiore per aree di interesse più piccole che sono lontane dai punti zero nei piani anteroposterior o dorsoventral e / o quando si studiano animali di dimensioni variabili a causa dell’età, della tensione e / o del sesso. Ci sono diverse sfide aggiuntive che sono uniche per il midollo allungato e il cordone cervicale superiore. In primo luogo, piccoli cambiamenti nelle coordinate anteroposteriore sono associati a cambiamenti significativi nelle coordinate dorsoventrali rispetto alla dura, a causa della posizione e della forma del cervelletto (Figura 1Bi)2,6,7. In secondo luogo, il cordone cervicale superiore non è contenuto all’interno del cranio2. In terzo luogo, la posizione obliqua dell’osso occipitale e lo strato sovrastante dei muscoli del collo2 rendono l’approccio stereotassico standard ancora più impegnativo per le strutture situate vicino alla transizione tra il tronco cerebrale e il midollo spinale (Figura 1Bi). Infine, molti bersagli di interesse nel tronco cerebrale caudale e nel midollo cervicale sono piccoli2, che richiedono iniezioni precise e riproducibili 8,9.

Un approccio alternativo attraverso la cisterna magna aggira questi problemi. La cisterna magna è un grande spazio che si estende dall’osso occipitale all’atlante (Figura 1A, cioè il secondo osso vertebrale)10. È riempito con liquido cerebrospinale e coperto da dura madre10. Questo spazio tra l’osso occipitale e l’atlante si apre quando si anterofisce la testa. È possibile accedervi navigando tra le pance accoppiate sovrastanti del muscolo longus capitis, esponendo la superficie dorsale del tronco cerebrale caudale. Le regioni di interesse possono quindi essere prese di mira in base ai punti di riferimento di queste regioni stesse se si trovano vicino alla superficie dorsale; o usando l’obex, il punto in cui il canale centrale si apre nel ventricolo IV, come punto zero per le coordinate per raggiungere strutture più profonde. Questo approccio è stato utilizzato con successo in una varietà di specie, tra cui il ratto11, il gatto12, il topo 8,9 e il primate non umano13 per colpire il gruppo respiratorio ventrale, la formazione reticolare mediale midollare, il nucleo del tratto solitario, l’area postrema o il nucleo ipoglosso. Tuttavia, questo approccio non è ampiamente utilizzato in quanto richiede conoscenze di anatomia, un toolkit specializzato e competenze chirurgiche più avanzate rispetto all’approccio stereotassico standard.

Qui descriviamo un approccio chirurgico passo-passo per raggiungere il tronco cerebrale e il cordone cervicale superiore attraverso la cisterna magna, visualizzare i punti di riferimento, impostare il punto zero (Figura 2) e stimare e ottimizzare le coordinate target per la consegna stereotassica di microiniezioni nelle regioni discrete del tronco cerebrale e del midollo spinale di interesse (Figura 3). Discutiamo quindi i vantaggi e gli svantaggi legati a questo approccio.

Protocol

L’autore dichiara che il protocollo segue le linee guida del Comitato istituzionale per la cura e l’uso degli animali presso il Beth Israel Deaconess Medical Center. 1. Preparazione di strumenti chirurgici e telaio stereotassico NOTA: L’intervento viene eseguito in condizioni asettiche. La sterilità viene mantenuta utilizzando la tecnica della punta sterile. Installare il braccio stereotassico con una micropipetta o una siringa riempita c…

Representative Results

L’approccio cisterna magna consente di colpire il tronco cerebrale caudale e le strutture del cordone cervicale superiore che sono altrimenti difficili da raggiungere tramite approcci stereotassici standard o sono inclini a targeting incoerente. L’intervento chirurgico per raggiungere la cisterna magna richiede incisioni della pelle, un sottile strato di muscolo trapezio e l’apertura della dura madre ed è quindi ben tollerato dai topi. È particolarmente efficiente e meno invasivo quando si prendono di mira pi?…

Discussion

La chirurgia stereotassica standard si basa comunemente sui punti di riferimento del cranio per calcolare le coordinate dei siti target nel SNC1. I siti bersaglio sono quindi accessibili tramite fori di bava che vengono perforati attraverso il cranio1. Questo metodo non è ideale per il tronco cerebrale caudale in quanto i siti bersaglio si trovano distanti dai punti di riferimento del cranio nei piani anteroposteriore e dorsoventrale2 e poi…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato supportato da R01 NS079623, P01 HL149630 e P01 HL095491.

Materials

Alcohol pad Med-Vet International SKU: MDS090735Z skin preparation for the prevention of surgical site infection
Angled forceps, Dumont #5/45 FST 11251-35 only to grab dura
Betadine pad Med-Vet International SKU:PVP-PAD skin preparation for the prevention of surgical site infection
Cholera toxin subunit-b, Alexa Fluor 488/594 conjugate Thermo Fisher Scientific 488: C34775, 594: C22842 Fluorescent tracer
Clippers Wahl Model MC3, 28915-10 for shaving fur at surgical site
Electrode holder with corner clamp Kopf 1770 to hold glass pipette
Flowmeter Gilmont instruments model # 65 MM to regulate flow of isoflurane and oxygen to mouse on the surgical plane
Fluorescent microspheres, polystyrene Thermo Fisher Scientific F13080 Fluorescent tracer
Heating pad Stoelting 53800M thermoregulation
Induction chamber with port hook up kit Midmark Inc 93805107 92800131 chamber providing initial anasthesia
Insulin Syringe Exelint International 26028 to administer saline and analgesic
Isoflurane Med-Vet International SKU:RXISO-250 inhalant anesthetic
Isoflurane Matrix VIP 3000 vaporizer Midmark Inc 91305430 apparatus for inhalant anesthetic delivery
Laminectomy forceps, Dumont #2 FST 11223-20 only to clean dura
Medical air, compressed Linde UN 1002 used with stimulator & PicoPump for providing air for precision solution injection
Meloxicam SR Zoo Pharm LLC Lot # MSR2-211201 analgesic
Microhematocrit borosilicate glass pre calibrated capillary tube Globe Scientific Inc 51628 for transfection of material to designated co-ordinates
Mouse adaptor Stoelting 0051625  adapting rat stereotaxic frame for mouse surgery
Needle holder, Student Halsted- Mosquito Hemostats FST 91308-12 for suturing
Oxygen regulator Life Support Products S/N 909328, lot 092109 regulate oxygen levels from oxygen tank
Oxygen tank, compressed Linde USP UN 1072 provided along with isoflurane anasthesia
Plastic card not applicable not applicable any firm plastic card, cut to fit the stereotactic frame (e.g. ID card)
Pneumatic PicoPump ( or similar) World Precision Instruments (WPI) SYS-PV820 For precision solution injection
Saline, sterile Mountainside Medical Equipment H04888-10 to replace body fluids lost during surgery
Scalpel handle, #3 FST 10003-12 to hold scalpel
Scissors, Wagner FST 14070-12 to cut polypropylene suture
Spring scissors, Vannas 2.5mm with accompanying box FST 15002-08 scissors only to open dura, box to elevate body
Stereotactic micromanipulator Kopf 1760-61 attached to electrode holder to adjust position based on co-ordinates
Stereotactic 'U' frame assembly and intracellular base plate Kopf 1730-B, 1711 frame for surgery
Sterile cotton tipped applicators Puritan 25-806 10WC absorbing blood from surgical field
Sterile non-fenestrated drapes Henry Schein 9004686 for sterile surgical field
Sterile opthalmic ointment Puralube P1490 ocular lubricant
Stimulator & Tubing Grass Medical Instruments S44 to provide controlled presurred air for precision solution injection
Surgical Blade #10 Med-Vet International SKU: 10SS for skin incision
Surgical forceps, Extra fine Graefe FST 11153-10 to hold skin
Surgical gloves Med-Vet International MSG2280Z for asceptic surgery
Surgical microscope Leica Model M320/ F12 for 5X-40X magnification of surgical site
Suture 5-0 polypropylene Oasis MV-8661 to close the skin
Tegaderm 3M 3M ID 70200749250 provides sterile barrier
Universal Clamp and stand post Kopf 1725 attached to stereotactic U frame and intracellular base plate
Wound hook with hartman hemostats FST 18200-09, 13003-10 to separate muscles and provide surgical window

References

  1. JoVE. Rodent Stereotaxic Surgery. JoVE Science Education Database. , (2021).
  2. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2001).
  3. Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).
  4. Rangarajan, J. R., et al. Image-based in vivo assessment of targeting accuracy of stereotactic brain surgery in experimental rodent models. Scientific Reports. 6 (1), 38058 (2016).
  5. Blasiak, T., Czubak, W., Ignaciak, A., Lewandowski, M. H. A new approach to detection of the bregma point on the rat skull. Journal of Neuroscience Methods. 185 (2), 199-203 (2010).
  6. Popesko, P., Rajtova, V., Horak, J. . A Colour Atlas of the Anatomy of Small Laboratory Animals, Volume 2: Rat, Mouse and Golden Hamster. 2, (1992).
  7. Allen Mouse Brain Atlas. Allen Institute for Brain Science Available from: https://mouse.brain-map.org/experiment/thumbnails/100042147?image_type=atlas (2004)
  8. Vanderhorst, V. G. J. M. Nucleus retroambiguus-spinal pathway in the mouse: Localization, gender differences, and effects of estrogen treatment. The Journal of Comparative Neurology. 488 (2), 180-200 (2005).
  9. Yokota, S., Kaur, S., VanderHorst, V. G., Saper, C. B., Chamberlin, N. L. Respiratory-related outputs of glutamatergic, hypercapnia-responsive parabrachial neurons in mice. Journal of Comparative Neurology. 523 (6), 907-920 (2015).
  10. Anselmi, C., et al. Ultrasonographic anatomy of the atlanto-occipital region and ultrasound-guided cerebrospinal fluid collection in rabbits (Oryctolagus cuniculus). Veterinary Radiology & Ultrasound. 59 (2), 188-197 (2018).
  11. Herbert, H., Moga, M. M., Saper, C. B. Connections of the parabrachial nucleus with the nucleus of the solitary tract and the medullary reticular formation in the rat. The Journal of Comparative Neurology. 293 (4), 540-580 (1990).
  12. Vanderhorst, V. G., Holstege, G. Caudal medullary pathways to lumbosacral motoneuronal cell groups in the cat: evidence for direct projections possibly representing the final common pathway for lordosis. The Journal of Comparative Neurology. 359 (3), 457-475 (1995).
  13. Vanderhorst, V. G., Terasawa, E., Ralston, H. J., Holstege, G. Monosynaptic projections from the nucleus retroambiguus to motoneurons supplying the abdominal wall, axial, hindlimb, and pelvic floor muscles in the female rhesus monkey. The Journal of Comparative Neurology. 424 (2), 233-250 (2000).
  14. Wall, N. R., Wickersham, I. R., Cetin, A., De La Parra, M., Callaway, E. M. Monosynaptic circuit tracing in vivo through Cre-dependent targeting and complementation of modified rabies virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21848-21853 (2010).
  15. Krashes, M. J., et al. Rapid, reversible activation of AgRP neurons drives feeding behavior in mice. The Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1424-1428 (2011).
  16. Ganchrow, D., et al. Nucleus of the solitary tract in the C57BL/6J mouse: Subnuclear parcellation, chorda tympani nerve projections, and brainstem connections. The Journal of Comparative Neurology. 522 (7), 1565-1596 (2014).
  17. Ung, K., Arenkiel, B. R. Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (68), e50004 (2012).

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Citer Cet Article
Joshi, K., Kirby, A., Niu, J., VanderHorst, V. Stereotaxic Surgical Approach to Microinject the Caudal Brainstem and Upper Cervical Spinal Cord via the Cisterna Magna in Mice. J. Vis. Exp. (179), e63344, doi:10.3791/63344 (2022).

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