Aislamiento de células endoteliales retinianas murinas para secuenciación de próxima generación
Summary
Este protocolo describe un método para el aislamiento de células endoteliales retinianas postnatales murinas optimizadas para el rendimiento, la pureza y la viabilidad celular. Estas células son adecuadas para los enfoques de secuenciación de próxima generación.
Abstract
Las mejoras recientes en la secuenciación de próxima generación han avanzado el conocimiento de los investigadores de la biología molecular y celular, con varios estudios que revelan nuevos paradigmas en biología vascular. La aplicación de estos métodos a modelos de desarrollo vascular requiere la optimización de técnicas de aislamiento celular a partir de tejidos embrionarios y postnatales. El rendimiento, la viabilidad y la pureza de la célula deben ser máximos para obtener resultados precisos y reproducibles de los enfoques de secuenciación de próxima generación. El modelo de vascularización retiniana neonatal de ratón es utilizado por los investigadores para estudiar los mecanismos del desarrollo vascular. Los investigadores han utilizado este modelo para investigar los mecanismos de la angiogénesis y la especificación del destino arterial-venoso durante la formación y maduración de los vasos sanguíneos. La aplicación de técnicas de secuenciación de próxima generación para estudiar el modelo de desarrollo vascular retiniano requiere la optimización de un método para el aislamiento de las células endoteliales de la retina que maximice el rendimiento, la viabilidad y la pureza celular. Este protocolo describe un método para el aislamiento, digestión y purificación del tejido retiniano murino mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). Los resultados indican que la población de células endoteliales CD31+/CD45- purificada por FACS está altamente enriquecida para la expresión génica de las células endoteliales y no presenta cambios en la viabilidad durante 60 minutos después del FACS. Se incluyen resultados representativos de enfoques de secuenciación de próxima generación en células endoteliales aisladas utilizando este método, incluida la secuenciación de ARN a granel y la secuenciación de ARN de células individuales, lo que demuestra que este método para el aislamiento de células endoteliales de la retina es compatible con las aplicaciones de secuenciación de próxima generación. Este método de aislamiento de células endoteliales retinianas permitirá técnicas avanzadas de secuenciación para revelar nuevos mecanismos de desarrollo vascular.
Introduction
La capacidad de alto rendimiento de la secuenciación de ácidos nucleicos a través de enfoques de secuenciación de próxima generación ha avanzado enormemente el conocimiento de los investigadores de biología molecular y celular. Estas técnicas avanzadas incluyen la secuenciación de ARN del transcriptoma completo, la secuenciación del ADN de regiones específicas para identificar polimorfismos de nucleótido único (SNP), la secuenciación del ADN de factores de transcripción unidos en la secuenciación de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) o regiones de cromatina abierta en el ensayo para la secuenciación de cromatina accesible por transposasa (ATAC) y la secuenciación de ARN unicelular1 . En biología vascular, estos avances han permitido a los investigadores dilucidar mecanismos complicados de desarrollo y enfermedad, junto con la distinción de patrones de expresión génica a lo largo de un continuo de fenotipos variables 2,3. Los experimentos futuros pueden definir aún más mecanismos complejos combinando la secuenciación de próxima generación con modelos evaluados de desarrollo vascular, pero los métodos para la preparación de muestras deben ser compatibles con las técnicas avanzadas de secuenciación.
La calidad, precisión y reproducibilidad de los enfoques de secuenciación de próxima generación dependen del método de preparación de la muestra. Al aislar un subconjunto de células o generar suspensiones unicelulares a partir de tejidos, los métodos óptimos de digestión y purificación son esenciales para maximizar el número celular, la viabilidad y la pureza de la población celular 4,5. Esto requiere un equilibrio en el método de digestión: la digestión fuerte es necesaria para liberar células del tejido y obtener suficientes células para los enfoques posteriores, pero la viabilidad celular se verá afectada negativamente si la digestión es demasiado fuerte 6,7. Además, la pureza de la población celular es necesaria para obtener resultados sólidos y un análisis preciso de los datos, que se puede lograr a través de FACS. Esto resalta la importancia de optimizar los métodos de aislamiento celular para aplicar la secuenciación de próxima generación a modelos establecidos de desarrollo vascular.
Un modelo bien caracterizado para investigar el desarrollo vascular es el modelo murino de desarrollo vascular retiniano. La vasculatura retiniana murina se desarrolla postnatalmente en un plexo superficial bidimensional, con brotación angiogénica inicial del nervio óptico visible en el día postnatal (P)3, frente angiogénico con células del tallo y de la punta y maduración inicial del vaso visible en P6, y maduración del plexo vascular visible después de P9 8,9. Durante la remodelación del plexo vascular inicial, las células endoteliales se especifican hacia fenotipos arteriales, capilares y venosos en diferentes vasos para generar una red circulatoria10,11. Por lo tanto, este método permite a los investigadores visualizar la formación del plexo vascular angiogénico y la especificación y maduración arterial-venosa endotelial en varios puntos de tiempo durante el desarrollo9. Además, este modelo proporciona un método para investigar los efectos de la manipulación transgénica sobre la angiogénesis y el desarrollo del plexo vascular, que se ha aplicado para la investigación del desarrollo vascular, malformaciones arteriales-venosas y neovascularización inducida por oxígeno 12,13,14,15,16 . Para combinar los enfoques de secuenciación de próxima generación con el modelo de desarrollo vascular retiniano murino, es necesario un protocolo optimizado para el aislamiento de las células endoteliales del tejido retiniano.
Este protocolo describe un método optimizado para digerir el tejido retiniano de ratones en P6 para maximizar el rendimiento celular, la pureza y la viabilidad. El tejido retiniano se aísla de ratones P6, se digiere durante 20 minutos, se inmunotiñe para CD31 y CD45 y se purifica a través de FACS para aislar una suspensión unicelular de células endoteliales en aproximadamente 2,5 h (Figura 1A). Se encontró que estas células endoteliales mantienen una alta viabilidad durante 60 minutos después del aislamiento17, lo que permite la preparación de la biblioteca para los métodos de secuenciación de próxima generación. Además, se proporcionan resultados representativos para la activación del sistema de control de control de calidad y el sistema de control de calidad de dos métodos separados de secuenciación de próxima generación que utilizan este protocolo de aislamiento: secuenciación de ARN del transcriptoma completo y secuenciación de ARN unicelular. Este método permite que los enfoques de secuenciación de próxima generación se utilicen junto con el modelo de vascularización retiniana para dilucidar nuevos mecanismos de desarrollo vascular.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo describe un método para el aislamiento de células endoteliales del tejido retiniano murino postnatal que se ha optimizado para un alto número de células, pureza y viabilidad. La pureza celular se obtiene mediante el aislamiento FACS de poblaciones de células endoteliales de la suspensión unicelular digerida mediante inmunotinción CD31+/CD45-. La calidad del aislamiento se cuantifica en ensayos de viabilidad mediante tinción con azul de tripano y expresión génica por qPCR para CD31, CD45 y VE-cadh…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gracias a Yale Flow Cytometry Facility, University of Virginia Flow Cytometry Core Facility, Yale Center for Genomic Analysis y University of Virginia Genome Analysis and Technology Core por su esfuerzo, experiencia y asesoramiento para contribuir a los experimentos presentados. Este estudio fue financiado por subvenciones de los NIH a N.W.C. (T32 HL007224, T32 HL007284), S.C. (T32 HL007284), K.W. (R01 HL142650) y K.K.H. (R01 HL146056, R01 DK118728, UH3 EB025765).
Materials
| 2 mL Eppendorf safe-lock tubes | USA Scientific | 4036-3352 | |
| 5 ml Falcon Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | |
| 60 mm Non TC-treated Culture Dish | Corning | 430589 | |
| APC Rat Anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | 551262 | |
| APC Rat IgG2a κ Isotype Control | BD Biosciences | 553932 | |
| BD FACSChorus Software | BD Biosciences | FACSCHORUS | |
| BD FACSMelody Cell Sorter | BD Biosciences | FACSMELODY | |
| Collagenase Type II | Sigma-Aldrich | 234115 | |
| Costar 48-well Clear TC-treated Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile | Corning | 3548 | |
| D-Glucose | Gibco | A2494001 | |
| Disposable Graduated Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 12-711-9AM | |
| Dissecting Pan Wax | Carolina | 629100 | |
| Dissection scissors | Fine Science Tools | 14085-08 | |
| Dissection Stereo Microscope M165 FC | Leica | M165FC | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-052 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190144 | |
| Eppendorf Flex-Tubes Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Sigma-Aldrich | 22364120 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio | 100-106 | |
| Fine dissection forceps | Fine Science Tools | 11250-00 | |
| Hank's Buffered Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14175095 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630130 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708890 | |
| Isoflurane, USP | Covetrus | 11695067772 | |
| Isotemp General Purpose Deluxe Water Bath | Fisher Scientific | FSGPD20 | |
| Primer: ActB_Forward: 5’- agagggaaatcgtgcgtgac -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: ActB_Reverse: 5’- caatagtgatgacctggccgt -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: CD31_Forward: 5’- gagcccaatcacgtttcagttt -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: CD31_Reverse: 5’- tccttcctgcttcttgctagct -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: CD45_Forward: 5’- gggttgttctgtgccttgtt -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: CD45_Reverse: 5’- ctggacggacacagttagca -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: VE-Cadherin_Forward: 5’- tcctctgcatcctcactatcaca -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: VE-Cadherin_Reverse: 5’- gtaagtgaccaactgctcgtgaat -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | |
| Sorvall Legend Micro 21R Centrifuge, Refrigerated | ThermoFisher | 75002477 | |
| SYBR-Green iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5120 | |
| Trypan Blue Solution | ThermoFisher | 15250061 | |
| V450 Rat Anti-Mouse CD45 | BD Biosciences | 560501 | |
| V450 Rat IgG2b, κ Isotype Control | BD Biosciences | 560457 |
References
- Slatko, B. E., Gardner, A. F., Ausubel, F. M. Overview of next-generation sequencing technologies. Current Protocols in Molecular Biology. 122 (1), 59 (2018).
- Chavkin, N. W., Hirschi, K. K. Single cell analysis in vascular biology. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 7, 42 (2020).
- Ma, F., Hernandez, G. E., Romay, M., Iruela-Arispe, M. L. Single-cell RNA sequencing to study vascular diversity and function. Current Opinion in Hematology. 28 (3), 221-229 (2021).
- Potter, A. S., Potter, S. S., S, Dissociation of tissues for single-cell analysis. Methods in Molecular Biology. 1926, 55-62 (2019).
- Braga, F. A. V., Miragaia, R. J. Tissue handling and dissociation for single-cell RNA-seq. Single Cell Methods: Methods in Molecular Biology. 1979, 9-21 (2019).
- Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociatin-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
- Skulska, K., Wegrzyn, A. S., Chelmonska-Soyta, A., Chodaczek, G. Impact of tissue enzymatic digestion on analysis of immune cells in mouse reproductive mucosa with a focus on gammadelta T cells. Journal of Immunological Methods. 474, 112665 (2019).
- Connolly, S., Hores, T., Smith, L., D’Amore, P. Characterization of vascular development in the mouse retina. Microvascular Research. 36 (3), 275-290 (1988).
- Crist, A., Young, C., Meadows, S. Characterization of arteriovenous identity in the developing neonate mouse retina. Gene Expression Patterns: GEP. 23-24, 22-31 (2017).
- dela Paz, N. G., D’Amore, P. A. Arterial versus venous endothelial cells. Cell and Tissue Research. 335 (1), 5-16 (2009).
- Fang, J. S., Hirschi, K. K. Molecular regulation of arteriovenous endothelial cell specification. F1000Res. 8, (2019).
- Smith, L. E., et al. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 35 (1), 101-111 (1994).
- Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice. Nature Protocols. 5 (9), 1518-1534 (2010).
- Ruiz, S., et al. A mouse model of hereditary hemorrhagic telangiectasia generated by transmammary-delivered immunoblocking of BMP9 and BMP10. Scientific Reports. 6, 37366 (2016).
- Fang, J. S., et al. Shear-induced Notch-Cx37-p27 axis arrests endothelial cell cycle to enable arterial specification. Nature Communication. 8 (1), 2149 (2017).
- Ola, R., et al. SMAD4 prevents flow induced arterial-venous malformations by inhibiting Casein Kinase 2. Circulation. 138 (21), 2379-2394 (2018).
- Chavkin, N. W., Walsh, K., Hirschi, K. K. Isolation of highly purified and viable retinal endothelial cells. Journal of Vascular Research. 58 (1), 49-57 (2020).
- Hulspas, R., O’Gorman, M. R. G., Wood, B. L., Gratama, J. W., Sutherland, D. R. Considerations for the control of background fluorescence in clinical flow cytometry. Cytometry PartB: Clinical Cytometry. 76 (6), 355-364 (2009).
- Bachman, J. Reverse-transcription PCR (RT-PCR). Methods in Enzymology. 530, 67-74 (2013).
- Green, M. R., Sambrook, J. Quantification of RNA by real-time Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR). Cold Spring Harbour Protocols. 2018 (10), (2018).
- Liu, L., Shi, G. P. CD31: beyond a marker for endothelial cells. Cardiovascular Research. 94 (1), 3-5 (2012).
- Zarkada, G., et al. Specialized endothelial tip cells guide neuroretina vascularization and blood-retina-barrier formation. Developmental Cell. 56 (15), 2237-2251 (2021).
- Su, X., Sorenson, C. M., Sheibani, N. Isolation and characterization of murine retinal endothelial cells. Molecular Vision. 9, 171-178 (2003).
- Benedito, R., et al. The notch ligands Dll4 and Jagged1 have opposing effects on angiogenesis. Cell. 137 (6), 1124-1135 (2009).
- Daneman, R., et al. Wnt/beta-catenin signaling is required for CNS, but not non-CNS, angiogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (2), 641-646 (2009).
- Okabe, K., et al. Neurons limit angiogenesis by titrating VEGF in retina. Cell. 159 (3), 584-596 (2014).
- Crist, A. M., Lee, A. R., Patel, N. R., Westhoff, D. E., Meadows, S. M. Vascular deficiency of Smad4 causes arteriovenous malformations: a mouse model of Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia. Angiogenesis. 21 (2), 363-380 (2018).
- Kim, Y. H., Choe, S. W., Chae, M. Y., Hong, S., Oh, S. P. SMAD4 deficiency leads to development of arteriovenous malformations in neonatal and adult mice. Journal of the American Heart Association. 7 (21), 009514 (2018).
- Ma, W., et al. Absence of TGFbeta signaling in retinal microglia induces retinal degeneration and exacerbates choroidal neovascularization. eLife. 8, 42049 (2019).
- Luo, W., et al. Arterialization requires the timely suppression of cell growth. Nature. 589 (7842), 437-441 (2021).
- Lawson, N. D., Vogel, A. M., Weinstein, B. M. sonic hedgehog and vascular endothelial growth factor act upstream of the Notch pathway during arterial endothelial differentiation. Developmental Cell. 3 (1), 127-136 (2002).
- Larrivee, B., et al. ALK1 signaling inhibits angiogenesis by cooperating with the Notch pathway. Developmental Cell. 22 (3), 489-500 (2012).
- Wythe, J. D., et al. ETS factors regulate Vegf-dependent arterial specification. Developmental Cell. 26 (1), 45-58 (2013).
- Davis, D. M., Purvis, J. E. Computational analysis of signaling patterns in single cells. Seminars in Cell and Developmental Biology. , 35-43 (2015).
- Gaudet, S., Miller-Jensen, K. Redefining signaling pathways with an expanding single-cell toolbox. Trends in Biotechnology. 34 (6), 458-469 (2016).
- Aibar, S., et al. SCENIC: single-cell regulatory network inference and clustering. Nature Methods. 14 (11), 1083-1086 (2017).
- Trapnell, C., et al. The dynamics and regulators of cell fate decisions are revealed by pseudotemporal ordering of single cells. Nature Biotechnology. 32 (4), 381-386 (2014).
