小鼠视网膜内皮细胞分离用于二代测序

通过下一代测序方法对核酸进行测序的高通量能力极大地提高了研究人员对分子和细胞生物学的认识。这些先进技术包括全转录组 RNA 测序、靶区 DNA 测序以鉴定单核苷酸多态性 （SNP）、染色质免疫沉淀 （ChIP） 测序中结合转录因子的 DNA 测序，或转座酶可及染色质 （ATAC） 测序测定中的开放染色质区域，以及单细胞 RNA 测序¹.在血管生物学中，这些进展使研究人员能够阐明复杂的发育和疾病机制，以及沿着不同^表型的连续统一体区分基因表达模式2^，3。未来的实验可以通过将下一代测序与评估的血管发育模型相结合来进一步定义复杂的机制，但样品制备方法需要与先进的测序技术兼容。

二代测序方法的质量、准确性和重现性取决于样品制备方法。当分离细胞亚群或从组织中产生单细胞悬液时，最佳的消化和纯化方法对于最大化^细胞群的细胞数量、活力和纯度至关重要4^，5。这需要消化方法的平衡：强消化对于从组织中释放细胞并获得足够的细胞用于下游方法是必要的，但如果消化^太强，细胞活力将受到负面影响6^，7。此外，细胞群的纯度对于可靠的结果和准确的数据分析是必要的，这可以通过FACS完成。这突出了优化细胞分离方法以将二代测序应用于已建立的血管发育模型的重要性。

用于研究血管发育的一个特征良好的模型是鼠视网膜血管发育模型。鼠视网膜脉管系统在出生后二维浅丛中发育，出生后第 （P）3 天从视神经可见初始血管生成萌芽，在 P6 处可见血管生成前部，有柄和尖端细胞，初始血管成熟可见，P9 8^，9 后可见血管丛成熟。在初始血管丛的重塑过程中，内皮细胞在不同血管中经历对动脉、毛细血管和静脉表型的规范，以产生循环网络^10，11。因此，该方法使研究人员^{能够在发育过程中}的不同时间点可视化血管生成血管丛形成和内皮动脉 – 静脉规格和成熟9。此外，该模型提供了一种研究转基因操作对血管生成和血管丛发育影响的方法，该方法已应用于研究血管发育、动脉静脉畸形和氧诱导的新生血管形成¹²，¹³，¹⁴，^15，16.为了将下一代测序方法与小鼠视网膜血管发育模型相结合，需要一种优化的方案，用于从视网膜组织中分离内皮细胞。

该协议描述了一种优化的方法，用于在P6下消化小鼠的视网膜组织，以最大限度地提高细胞产量，纯度和活力。从P6小鼠中分离视网膜组织，消化20分钟，对CD31和CD45进行免疫染色，并通过FACS纯化以在约2.5小时内分离内皮细胞的单细胞悬液（图1A）。发现这些内皮细胞在分离后60分钟内保持高活力¹⁷，允许为下一代测序方法进行文库制备。此外，还提供了使用该分离方案的两种独立的下一代测序方法的FACS门控和质量控制结果的代表性结果：全转录组RNA测序和单细胞RNA测序。该方法允许将下一代测序方法与视网膜血管化模型结合使用，以阐明血管发育的新机制。