단순 포진 바이러스의 플라쿼싱
Summary
Plaquing은 집단에서 살아있는 바이러스를 정량화하는 데 사용되는 일상적인 방법입니다. 박테리아와 박테리오파지를 이용한 다양한 미생물학 커리큘럼에서 플라킹이 자주 가르쳐지지만, 포유류 바이러스의 플라킹은 더 복잡하고 시간이 많이 걸립니다. 이 프로토콜은 단순 포진 바이러스와의 정기적 인 작업을 위해 안정적으로 기능하는 절차를 설명합니다.
Abstract
방법론에 대한 기본 문헌 내의 참고 문헌을 포함하여 바이러스를 플라킹하기위한 수많은 출판 된 프로토콜이 있습니다. 그러나 플라킹 바이러스는 수행하기가 어려울 수 있으므로 사양과 개선에 중점을 두어야합니다. 신입생이 마스터하는 것은 매우 어려운 방법이며, 주로 가장 세심한주의를 기울여야하기 때문입니다. 단순 포진 바이러스를 괴롭히는 이러한 시연은 수년에 걸쳐이 방법, 특히 뉘앙스를 시각화하는 데 어려움을 겪은 사람들을 도울 것입니다. 이 원고는 표준 플라킹 방법론의 동일한 원칙에 기초하지만, (1) 공정 중 파괴를 피하기 위해 숙주 세포를 가장 잘 다루는 방법, (2) 비리온의 확산을 제한하기 위해 아가로스보다 더 유용한 점성 배지, (3) 신뢰할 수 있게 재현 가능한 결과를 생성하는 간단한 고정 및 염색 절차에 대한 자세한 설명을 포함하고 있다는 점에서 다릅니다. 또한, 첨부 된 비디오는 플라크 분석을 수행하는 다른 사람들에게 지시 할 때 자주 놓치는 과정에서 더 미세한 구별을 입증하는 데 도움이됩니다.
Introduction
바이러스 플라크 분석의 시작은 1890 년대 바이러스의 첫 번째 발견으로 돌아갑니다1. 담배 모자이크 바이러스는 먼저 분리되어 담배 잎에 전달되었으며, 개별 감염 지점은 단일 살아있는 바이러스 엔티티2에서 유래 한 것으로 인식되고 정량화 될 수 있었으며 나중에 virion2로 확인되었습니다. 박테리아와 박테리오파지를 이용한 이후의 정액 연구는 성장의 중간 로그 단계의 박테리아, 박테리오파지 샘플의 연속 희석 및 박테리아 잔디밭의 문자 그대로의 구멍 (플라크로 명명 됨)의 후속 시각화를 통한 상단 한천을 포함하여 이러한 바이러스를 플라크하는 데 사용되는 기술을 완성했습니다3.
동물 바이러스의 플라쿼싱은 박테리오파지와 함께 수행되고 있는 흥미로운 연구가 지연되었는데, 그 이유는 주로 배양에서 포유동물 세포를 성장시키는 데 필요한 방법이 1940년대까지 개발되지 않았기 때문이다4. 그러나, 전체 숙주 유기체의 부재 하에 성장하는 뮤린 세포의 출현4은 바이러스를 배양하고 계수하는 능력의 새로운 시대를 열었다. 이러한 작업은 닭 세포에서 웨스턴 에퀸 뇌척수염 바이러스의 증식 및 정량화와 인간 세포에서의 폴리오바이러스5,6 동안 확장되었다. 배양 가능한 포유류 세포의 영역이 확장됨에 따라, 다양한 바이러스 감염에 대한 다양한 숙주 세포의 bevy는 모든 종류의 바이러스를 연구 할 수있는 가능성의 각막7을 세계에 주었다. 여기에는 인간 헤르페스바이러스, 특히 점막 피부 병변을 일으키는 단순 헤르페스 바이러스-1(HSV-1) 및 -2(HSV-2)의 전파 및 정량화가 포함되었다8. 중요하게도, 모든 플라크 검정은 살아있는 비리온의 존재에 의존하며, 이는 샘플9에서 수용체-매개된 방식으로 숙주 세포에 진입할 수 있다. 플라크 분석의 실행에 관한 편재성과 다수의 간행물에 관계없이5,10,11,12,13,14,15,16, HSV-1/-2에 대한 이러한 방법은 예술과 과학의 혼합물이다; 프로토콜의 모든 세부 사항에 적절한주의를 기울이지 않고 분석을 수행 할 수 없으며 프로세스의 미묘함에 대한 비판적 인 눈없이 성공적인 분석을 수행 할 수도 없습니다. 이 원고는 HSV-1/-2 플라크 분석을위한 가장 일관되게 재현 가능한 방법 중 하나를 묘사하며, 거의 논의되지 않는 분석의 기술에 대한 정확한 세부 사항을 보여줍니다.
이 현재 프로토콜은 HSV-1 및 -2에 대한 살아있는 플라크 형성 단위 (PFU) 카운트를 안정적으로 얻습니다. 가장 좋은 결과는 낮은 계대 (통과 번호 155 이하)에서 Vero 세포 (형질전환 된 아프리카 녹색 원숭이 신장 상피 세포)를 사용하고 10 % 태아 송아지 혈청 (FCS), L-알라닐-L-글루타민 및 항생제 / 항균제 혼합물로 보충 된 알파 MEM17에서 일상적으로 성장합니다18. 베로 세포는 표준적으로 이 배지에서 매주 두세 번 1/5 희석으로 전파된다.
Protocol
Representative Results
Discussion
플라크 분석은 포유류 세포 배양 자체만큼이나 오래되었지만, 각 실험실에는 이 기본 분석을 실행하기 위한 자체 프로토콜 세트가 있는 것으로 보입니다5,6,10,11,12,13,14,15,16,20 <sup class="xre…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 이러한 방법을 다듬는 수년에 걸쳐 우리와 함께 일해 온 우리 연구소 (PJD 및 BJM)의 수많은 학생들에게 감사드립니다. 이 방법론이 처음 개발 된 스탠 페르소나 (Stan Person)에게 특별한 감사를드립니다. 이 작업은 Towson University Fisher College of Science and Math Undergraduate Research Support 기금과 NIGMS Bridges가 Baccalaureate 보조금 5R25GM058264에 부분적으로 지원했습니다. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 국립 보건원 국립 의학 연구소의 공식 견해를 반드시 나타내는 것은 아닙니다.
Materials
| 12-well plates | Corning | 3512 | |
| 6-well plates | Corning | 3516 | |
| Alpha-MEM | Lonza | 12169F | |
| Antibiotic/antimycotic | Gibco | 15240096 | |
| Crystal violet | Alfa Aesar | B2193214 | |
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| Dulbecco's PBS (no Mg++ or Ca++) | Gibco | 14190144 | |
| Fetal calf serum | Millipore-Sigma | TMS-013-B | |
| L-alanyl-L-glutamine (Glutamax) | Gibco | GS07F161BA | |
| Hemacytometer | Thermo Fisher | 02-671-54 | |
| Methylcellulose | Millipore-Sigma | 27-441-0 | |
| Quaternary agent (Lysol I.C.) | Thermo Fisher | NC9645698 | |
| Trypan Blue | Corning | 25900CI | |
| Trypsin | Cytiva | SH30042.01 | |
| Vero cells | ATCC | CCL-81 |
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