Plaquierung von Herpes-simplex-Viren

Die Anfänge der Virus-Plaque-Assays gehen auf die ersten Entdeckungen von Viren in den 1890er Jahren ^zurück1. Das Tabakmosaikvirus wurde zunächst isoliert und auf Tabakblättern weitergegeben, wo einzelne Infektionsflecken erkannt und quantifiziert werden konnten, die von einer einzigen, lebenden Virusentität ^stammten2, die später als Virion identifiziert ^wurde2. Spätere bahnbrechende Studien mit Bakterien und Bakteriophagen perfektionierten die Techniken, die verwendet wurden, um diese Viren zu beflecken, einschließlich Bakterien in der Mid-Log-Phase des Wachstums, serielle Verdünnung von Bakteriophagenproben und Top-Agar mit anschließender Visualisierung von buchstäblichen Löchern (benannte Plaques^{) im Bakterienrasen3.}

Das Plaquieren von Tierviren hinkte der spannenden Forschung mit Bakteriophagen hinterher, vor allem, weil die Methoden, die für die Züchtung von Säugetierzellen in Kultur erforderlich sind, erst in den 1940er Jahren entwickelt ^wurden4. Das Aufkommen von wachsenden murinen Zellen in Abwesenheit des gesamten Wirtsorganismus4 brachte jedoch eine neue Ära in der Fähigkeit hervor, Viren zu kultivieren und zu zählen^. Diese Arbeiten wurden für die Vermehrung und Quantifizierung des Western Equine Encephalomyelitis-Virus in Hühnerzellen und des Poliovirus in menschlichen Zellen ^erweitert5,6. Als sich der Bereich der kultivierbaren Säugetierzellen ausdehnte, gab die Schar verschiedener Wirtszellen für verschiedene Virusinfektionen der Welt ein Füllhorn von Möglichkeiten, alle Arten von Viren zu ^{untersuchen7.} Dazu gehörte die Vermehrung und Quantifizierung von humanen Herpesviren, insbesondere Herpes-simplex-Viren-1 (HSV-1) und -2 (HSV-2), die mukokutane Läsionen ^verursachen8. Wichtig ist, dass alle Plaque-Assays von der Existenz lebender Virionen abhängig sind, die in einer Probe rezeptorvermittelt in Wirtszellen eindringen ^können9. Unabhängig von der Allgegenwart und Vielzahl von Publikationen zur Durchführung von Plaque-Assays5,10,11,12,13,14,15,16 sind diese Methoden für HSV-1/-2 eine Mischung aus Kunst und Wissenschaft; Man kann den Assay nicht ohne angemessene Aufmerksamkeit für jedes Detail im Protokoll durchführen, noch kann man einen erfolgreichen Assay ohne ein kritisches Auge für Subtilität im Prozess durchführen. Dieses Manuskript zeigt eine der konsistentesten reproduzierbaren Methoden für HSV-1/-2-Plaque-Assays, mit präzisen Details zur Kunst des Assays, die selten diskutiert werden.

Dieses aktuelle Protokoll erhält zuverlässig lebende plaquebildende Einheiten (PFU) für HSV-1 und -2. Die besten Ergebnisse werden unter Verwendung von Vero-Zellen (transformierte Nierenepithelzellen des afrikanischen grünen Affen) bei niedriger Passage (unter Passage Nummer 155) erzielt und routinemäßig in alpha-MEM17 gezüchtet^, ergänzt mit 10% fetalem Kälberserum (FCS), L-Alanyl-L-Glutamin und einer antibiotischen/antimykotischen ^Mischung18. Vero-Zellen werden in diesem Medium standardmäßig zwei- bis dreimal pro Woche mit ^{einer 1}/_{5-Verdünnung} jedes Mal vermehrt.