직렬 블록-얼굴 스캐닝 전자 현미경 검사(SBEM)는 뮤린 해마의 수지상 척추를 이미지 및 분석하기 위해 적용된다.
3차원 전자 현미경 검사법(3D EM)은 나노 스케일 분해능을 사용하여 수지상 척추의 형태학적 파라미터를 분석할 수 있는 가능성을 제공합니다. 또한, 척추 및 시냅스 후 밀도(PSD)의 부피(시냅스 후 부분, 시냅스 후 부분), 프리시냅틱 단말의 존재, 부드러운 내시경 망상 또는 비정형 형태의 PSD(예를 들어, 다중 내압 스핀)와 같은 수지상 척추의 일부 특징은 EM3D로만 관찰될 수 있다. 직렬 블록-얼굴 스캐닝 전자 현미경 검사(SBEM)를 채용함으로써 기존의 직렬 단면을 수행할 때보다 3D EM 데이터를 보다 쉽고 재현 가능한 방식으로 얻을 수 있다. 여기서 우리는 SBEM 분석을 위한 마우스 해마 견본을 준비하는 방법 및 이 프로토콜이 수지상 척추의 면역 형광 연구 결과와 어떻게 결합될 수 있는지 보여줍니다. 온화한 고정 관류는 우리가 두뇌의 반에 가벼운 현미경 검사법을 가진 면역 형광 연구를 능력을 발휘할 수 있게 하고, 나머지 반은 SBEM을 위해 준비되었습니다. 이 접근은 연구 결과에 사용될 동물의 수를 감소시킵니다.
중추 신경계의 흥분 시냅스의 대부분은 수지상 척추에 위치합니다 – 신경 막의 작은 돌출. 이러한 돌출은 세포내 신호 변환을 제어하는 제한된 생화학 적 구획을 형성합니다. 수지상 척추 및 시냅스의 구조적 가소성은 학습 및 메모리1,2와 같은 중요한 과정의 기초가 되는 시냅스 효능의 기능적 변화와 밀접한 관련이있다. 전자 현미경 검사법(EM)은 수지상 척추에 사전 시냅스 입력이 있는지 확인할 수 있는 유일한 기술입니다. EM 해상도는 또한 시냅스의 포스트냅스 부분 또는 수지상 척추의 치수를 나타내는 포스트 냅스 밀도(PSD)의 모양과 같은 초구조적 세부 사항뿐만 아니라 축삭 부톤의 크기와 모양을 연구하는 데 필요합니다. 또한 EM을 사용하면 시냅스와 주변 환경을 시각화할 수 있습니다.
이미징 및 컴퓨팅 기술의 발전 덕분에 전체 신경 회로를 재구성할 수 있습니다. 직렬 단면 투과 전자 현미경 검사법(ssTEM), 직렬 블록-페이스 스캐닝 전자 현미경검사(SBEM), 및 집중이온 빔 스캐닝 전자 현미경검사법(FIB-SEM)과 같은 부피 전자 현미경 기술은 일반적으로 뉴런 회로 재구성3에사용된다.
우리의 연구에서, SBEM 방법은 마우스 해마와 조직 뇌 슬라이스 4,5의샘플에서 수지상 척추와 PSDs의 구조적 가소성을 조사하기 위해 성공적으로 채택된다. SBEM은 스캐닝 전자 현미경 챔버6,7,8,9내부에 소형 초미세토메를 설치하는 것을 기반으로 한다. 샘플 블록의 상단은 이미지화되고, 샘플은 초미세토메에 의해 지정된 깊이로 절단되어 새로운 블록 면을 드러내며, 이는 다시이미지화된 다음 프로세스가 8반복된다. 그 결과, 절단된 슬라이스가 파편으로 손실되는 동안 블록 페이스의 이미지만 남게 됩니다. 그렇기 때문에 SBEM은 파괴적인 기술이라고 불리며, 이는 동일한 장소를 다시 이미지화할 수 없다는 것을 의미합니다. 그러나, 파괴적인 온블록 방법의 장점은 데이터 품질 및 데이터 분석3에크게 영향을 미칠 수 있는 뒤틀기 문제 및 절제손실로 인해 손해를 입지 않는다는 것이다. 또한, SBEM은 고해상도3에서상대적으로 넓은 시야(> 0.5mm × 0.5mm)를 이미지화할 수 있는 가능성을 제공한다.
SBEM을 사용하려면 이미지를 획득하는 데 사용되는 백산전자 검출기로 인해 전담적이고 대조적인 프로토콜에 따라 샘플을 준비해야 합니다. 1980년대8,11에서개발된 소슘-티오카르보히드라지데-오스뮴(rOTO) 얼룩을 사용하여 Deerinck10(국립 현미경 및 이미징 연구 센터(NCMIR) 방법에 의해 개발된 절차에 따라 시료 준비를 수행하는 방법을 여기에서 보여 준다. 또한 가벼운 현미경 검사법과 SBEM을 사용하여 면역 형광 연구에 동일한 뇌를 사용할 수있는 가벼운 고정 관류와 함께 2 단계 고정 접근 법을 소개합니다.
프로토콜에서 마우스 뇌는 주로 가벼운 고정제로 고정된 다음 반구로 절단한 다음, 한 반구는 면역 형광(IF)을 위해 포스트 고정 및 준비되고, 다른 하나는 EM 연구를 위한반면(그림 1).
그림 1. SBEM을 통해 분석을 위한 수지상 척추 준비에 대한 워크플로우의 회로도 표현. 마우스는 희생되고 온화한 1 차 고정으로 perfused되었습니다. 뇌는 반으로 절단되었고, 한 반구는 면역 형광 (IF)전용 고정, 냉동 보호, 극저온을 사용하여 슬라이스하고 IF 연구를 위해 처리되었으며, 다른 반구는 EM 고정으로 후징되고 진동체로 슬라이스되어 EM 연구를 준비했습니다. SBEM 연구를 위한 뇌 슬라이스는 대조되고, 수지에 평평한 내장, 해마의 CA1 부위가 핀에 장착되고, SBEM(도1)으로이미지되었다. 노란색 상자에 강조 표시된 프로토콜의 일부가 비디오에 등장했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
2010 년10에서Deerinck에 의해 설명 된 기본 NCMIR 방법의 많은 변형이 있습니다. 기본 원칙은 동일하게 유지되지만 연구된 자료유형에 따라 약간의 변화가 구현됩니다. 이전에는 상이한 수지가 SBEM용 시편을 포함시키는 데 사용될 수 있으며, 예를 들어 식물의 경우, Spurr’s는세포벽(22,23)을통해 더 나은 침투를 허용하는 낮은 점도로 인해 선?…
The authors have nothing to disclose.
SBEM 이미징, 가벼운 현미경 이미징 및 전자 현미경 샘플 제제는 Ncki 실험 생물학 연구소의 이미징 코어 시설로 작용하는 이미징 조직 및 기능 실험실의 장비를 사용하여 수행되었습니다.
도 1의 준비를 위해, 마우스(Souris_02)의 이미지와 https://smart.servier.com/ 바이알이 사용되었다.
이 작품은 국립 과학 센터 (폴란드) 그랜트 오푸스 (UMO-2018/31/B /NZ4/01603)에 의해 지원되었다 KR에 수여.
Anesthetic: | |||
Ketamine/xylazine mixture (Ketamina/Sedazin) | Biowet Pulawy, Pulawy, Poland | ||
Sodium pentobarbital (Morbital) | Biowet Pulawy, Pulawy, Poland | ||
Fixatives: | |||
Glutaraldehyde (GA) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | G5882 | Grade I, 25% in H2O, specially purified for use as an electron microscopy fixative |
Hydrochloric acid (HCl) | POCH, Gliwice, Poland | 575283115 | pure p.a. |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 441244 | prilled, 95% |
Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | P4417-50TAB | tablets |
Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | S5881 | reagent grade, 98%, pellets (anhydrous) |
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | S3264 | |
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | S3139 | |
Perfusion: | |||
Large blunt/blunt curved scissors (~14.5 cm) | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | 14519-14 | |
Micro-spatula (double 2" flat ends, one rounded, one tapered to 1/8") | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | 10091-12 | |
Needle tip, 15 GA, blunt (perfusion needle) | KD Medical GmbH Hospital Products, Berlin, Germany | KD-FINE 900413 | 1.80 x 40 mm |
Pair of fine (Graefe) tweezers | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | 11050-10 | |
Perfusion pump | Lead Fluid | BQ80S | |
Plastic vials | Profilab, Warsaw, Poland | 534.02 | plastic vials with blue cap for tissue storage, 20 ml, 31 x 48 mm |
Straight iris scissors (~9 cm) | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | 14058-11 | |
Brain slices preparation for EM: | |||
12-well plate | NEST, Rahway, NJ, USA | 712001 | |
Cyanoacrylic glue | Fenedur, Montevideo, Uruguay | ||
Glass vials | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 72632 | 20 ml Scintillation Vial, a pack of 100 |
Pasteur pipette | VWR, Radnor, PA, USA | 612-4545 | LDPE, disposable, 7.5 ml |
Razor blade | Wilkinson Sword, London, UK | Classic double edge safety razor blades | |
Scalpel blade | Swann-Morton, Sheffield, UK | No. 20 | |
Vibratome | Leica Microsystems, Vienna, Austria | Leica VT1000 S | |
Brain slices preparation for IF: | |||
96-well plate | NEST, Rahway, NJ, USA | 701101 | |
Criostat | Leica Microsystems, Vienna, Austria | Leica CM 1950 | |
Ethylene glycol | Bioshop, Burlington, Canada | ETH001 | |
Low-profile disposable blade 819 | Leica Biosystems Inc., USA | 14035838925 | |
Scalpel blade | Swann-Morton, Sheffield, UK | No. 20 | |
Sodium azide (NaN3) | POCH, Gliwice, Poland | 792770426 | |
Sucrose | POCH, Gliwice, Poland | 772090110 | |
Tissue freezing medium for cryosectioning, OCT-Compound | Leica Biosystems, Switzerland | 14020108926 | |
Immunostaining: | |||
24-well plate | NEST, Rahway, NJ, USA | 702001 | |
Anti-Post Synaptic Density Protein 95 Antibody | Merck-Millipore, Burlington, MA, USA | MAB1598 | |
Confocal microscope | Zeiss, Göttingen, Germany | Zeiss Spinning Disc microscope (63 × oil objective, NA 1.4, pixel size 0.13 µm × 0.13 µm) | |
Cover slide | Menzel Glaser, Braunschweig, Germany | B-1231 | 24 x 60 mm |
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | A31570 | |
Fluoromount-G Mounting Medium, with DAPI | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | 00-4959-52 | |
Microscope slide | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | AGAA00008 | SuperFrost |
Normal donkey serum (NDS) | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA | 017-000-121 | |
Shaker | JWElectronic, Warsaw, Poland | KL-942 | |
TritonT X-100 Reagent Grade | Bioshop, Burlington, Canada | TRX506 | |
Electron microsocpy sample preparation | |||
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate | POCH, Gliwice, Poland | 746980113 | |
Aclar 33C Film | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 50425 | Fluoropolymer Film embedding sheet |
DMP-30, 2,4,6-Tris(dimethylaminomethyl)phenol | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | T58203 | Epoxy embedding medium accelerator |
Durcupan ACM single component A, M | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 44611 | Durcupan ACM single component A, M epoxy resin |
Durcupan ACM single component B | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 44612 | Durcupan ACM single component B, hardener 964 |
Durcupan ACM single component D | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 44614 | Durcupan ACM single component D , plasticizer |
Ethyl alcohol absolute | POCH, Gliwice, Poland | 64-17-5 | Ethyl alcohol absolute 99.8 % pure P.A.-BASIC |
Genlab laboratory oven | Wolflabs, York, UK | Mino/18/SS | Oven Genlab MINO/18/SS 18l volume, no fan circulation, no digital display, standard temperature gradient, standard recovery rate, no timer, 250°C maximum temperature, 240V electrical supply |
L-Aspartic acid | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | A-9256 | reagent grade, 98% (HPLC) |
Lead (II) nitrate | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 467790 | 99.95% trace metals basis |
Osmium tetroxide | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 75632 | for electron microscopy, 4% in H2O |
pH meter | Elmetron, Zabrze, Poland | CP-5-5 | |
Rotator | BioSan, Józefów, Poland | Multi Bio RS-24 | rotator Multi Bio RS-24 |
Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | S5881 | reagent grade, 98%, pellets (anhydrous) |
Sunflower mini shaker | Grant bio, Shepreth,UK | PD-3D | |
Syringe filter | Millipore, Burlington, MA, USA | SLGP033NB | 0,22 µm pore size |
Thiocarbohydrazide | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 88535 | purum p.a., for electron microscopy, 99.0% (N) |
Uranyl acetate | Serva, Heidelberg, Germany | 77870 | Uranyl acetate·2H2O, research grade |
Water bath | WSL, Swietochlowice, Poland | LWT | |
Specimen mounting for SBEM | |||
96-well culture plate | VWR, Radnor, PA, USA | 734-2782 | 96-well plates, round bottom, non treated |
AM Gatan 3View stub handling tweezers | Micro to Nano, Haarlem, Netherlands Netherlands |
50-001521 | |
Binocular | OPTA-TECH, Warsaw, Poland | X2000 | |
Conductive glue | Chemtronics, Georgia, USA | CW2400 | conductive eopxy |
Gatan 3View sample pin stubs | Micro to Nano, Haarlem, Netherlands Netherlands |
10-006003 | |
Parafilm | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | P7793 | roll size 20 in. × 50 ft |
Pelco conductive silver paint | Ted Pella, Redding, CA, USA | 16062-15 | PELCO® Conductive Silver Paint, 15g |
Razor blades double edge | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 72000 | Stainless Steel "PTFE" coated. PERSONNA brand .004" thick, wrapped individually, 250 blades in a box. |
Scanning Electron Microscope | Zeiss, Oberkochen, Germany | Sigma VP with Gatan 3View2 chamber, acceleration voltage 2.5 kV, variable pressure 5 Pa, aperture 20 µm, dwell time 6 µs, slice thickness 60 nm, magnification 15 000 x, image resolution 2048 x 2048 pixels, pixel size 7.3 nm | |
trim 90° diamond knife | Diatome Ltd., Nidau, Switzerland | DTB90 | |
Ultramicrotome | Leica Microsystems, Vienna, Austria | Leica ultracutR | |
Software | webpage | tutorials | |
FijiJ | https://fiji.sc/ | ||
Microscopy Image Browser | http://mib.helsinki.fi/ | http://mib.helsinki.fi/tutorials.html | |
Reconstruct | https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0 | https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0) | |
Animals | |||
Mice | Adult 3-month old and 20±1 month old female Thy1-GFP(M) mice (Thy1-GFP +/-) (Feng et al.,2000) which express GFP in a sparsely distributed population of glutamatergic neurons. Animals were bred as heterozygotes with the C57BL/6J background in the Animal House of the Nencki Institute of Experimental Biology. |