用于登德里脊柱研究的串行块面扫描电子显微镜 （SBEM）

中枢神经系统中的大部分兴奋突触位于树突状脊柱上 – 神经元膜的小突起。这些突起形成密闭生化隔间，控制细胞内信号转导。树突状脊柱和突触的结构可塑性与突触功效的功能变化密切相关，突触功效的变化是学习和记忆^1、2等重要过程的基础。需要注意的是，电子显微镜 （EM） 是唯一能够确定树突状脊柱是否有突触前输入的技术。EM 分辨率还需要研究超结构细节，如后合成密度 （PSD） 的形状，代表突触的后合成部分，或树突脊柱的尺寸，以及轴突的大小和形状。此外，通过 EM，可以可视化突触及其周围环境。

由于成像和计算技术的进步，可以重建整个神经回路。体积电子显微镜技术，如串行节传输电子显微镜（sSTEM）、串行块面扫描电子显微镜（SBEM）和聚焦离子束扫描电子显微镜（FIB-SEM）等，常用于神经元电路重建^3。

在我们的研究中，SBEM方法成功地用于研究小鼠海马和有机性脑切片^4，5的样本中树突状脊柱和PSD的结构可塑性。SBEM基于扫描电子显微镜^{室6、7、8、9}内安装微型超微缩微切除器。对样品块顶部进行成像，然后由超微切除器在指定深度切割样品，露出新的块面，再次成像，然后重复^{过程 8。}因此，仅留下块面图像，而已切割的切片则丢失为碎屑。这就是为什么SBEM被称为破坏性技术，这意味着它不可能再次映像同一个地方。但是，破坏性块上方法的优点是它们不会遭受扭曲问题和部分丢失，这些问题和部分损失会显著影响数据质量和数据分析^3。此外，SBEM还提供了在高分辨率3下成像一个相对较大的视场（>0.5毫米^×0.5毫米）的可能性。

要使用 SBEM，由于用于获取图像的背散射电子探测器，因此必须按照专用的、高度对比的协议准备样品。我们在这里展示如何根据Dierinck^10（国家显微镜和成像研究中心（NCMIR）方法开发的程序，使用20世纪^{80年代8、11}年代开发的减少的硫化硫化物（rOTO）污渍来进行样品制备。此外，我们引入了两步固定方法，采用温和的固定灌注，允许使用相同的大脑进行轻显微镜和SBEM的免疫荧光研究。

在协议中，小鼠大脑主要用温和的固定剂固定，然后切成两半，一个半球固定后，准备免疫荧光（IF），而另一个半球用于EM研究（图1）。

图1。树突脊柱工作流程的示意图，为 SBEM 分析做准备。 老鼠被牺牲，并灌注了温和的原发性固定剂。大脑被切成两半，一个半球被免疫荧光（IF）专用固定，冷冻保护，使用低温统计器切片，并处理IF研究，而另一个半球被固定后与EM固定，切片与振动器和准备EM研究。用于SBEM研究的大脑切片进行了对比，平嵌在树脂中，然后海马的CA1区域被安装到针脚上，并用SBEM成像（图1）。视频中展示了黄色框中突出显示的协议部分。 请单击此处查看此图的较大版本。