Summary

Cribado cromosómico de embriones humanos preimplantacionales mediante el uso de medios de cultivo gastados: recogida de muestras y análisis de ploidía cromosómica

Published: September 07, 2021
doi:

Summary

El presente estudio reporta un protocolo para el tamizaje cromosómico de embriones humanos que utiliza medio de cultivo gastado, lo que evita la biopsia embrionaria y permite la identificación de ploidía cromosómica mediante NGS. El presente artículo presenta el procedimiento detallado, que incluye la preparación del medio de cultivo, la amplificación del genoma completo (WGA), la preparación de la biblioteca de secuenciación de nueva generación (NGS) y el análisis de datos.

Abstract

En la fertilización clínica in vitro (FIV), el método predominante para el PGT-A requiere la biopsia de unas pocas células del trofoectodermo (TE). Este es el linaje que forma la placenta. Este método, sin embargo, requiere habilidades especializadas, es invasivo y sufre de falsos positivos y negativos porque el número de cromosomas en el TE y la masa celular interna (MCI), que se desarrolla en el feto, no siempre son los mismos. La NICS, una tecnología que requiere la secuenciación del ADN que se libera en el medio de cultivo tanto desde TE como desde ICM, puede ofrecer una salida a estos problemas, pero se ha demostrado previamente que tiene una eficacia limitada. El presente estudio informa el protocolo completo de NICS, que incluye métodos de muestreo en medio de cultivo, amplificación del genoma completo (WGA) y preparación de bibliotecas, y análisis de datos de NGS mediante software de análisis. Teniendo en cuenta los diferentes tiempos de criopreservación en los diferentes laboratorios de embriones, los embriólogos tienen dos métodos para recolectar el medio de cultivo de embriones que se pueden seleccionar de acuerdo con las condiciones reales del laboratorio de FIV.

Introduction

Las tecnologías de reproducción asistida (TRA) se han utilizado cada vez más para el tratamiento de la infertilidad. Sin embargo, la tasa de éxito de las TRV, como la FIV, ha sido limitada, y la tasa de pérdida de embarazos es significativamente mayor que la de la población normal1. La principal causa de estos problemas son las anomalías cromosómicas, que existen comúnmente en los embriones humanos preimplantacionales2. El PGT-A es un método eficaz para evaluar el equilibrio cromosómico de los embriones antes de la implantación 3,4. Algunos estudios han demostrado que el PGT-A puede reducir la tasa de aborto y mejorar la tasa de embarazo 5,6,7,8. Sin embargo, el PGT-A requiere conocimientos técnicos complejos que requieren formación y experiencia específicas. El procedimiento invasivo de biopsia embrionaria también podría causar daño a los embriones9. Los estudios han demostrado que la biopsia de blastómeros puede dificultar el desarrollo posterior, y el número de TE biopsiadas puede afectar las tasas de implantación10. A pesar de que el problema de la biopsia embrionaria a largo plazo aún no ha sido evaluado a fondo en humanos, los estudios en animales han demostrado sus influencias negativas en el desarrollo embrionario11,12,13.

Informes anteriores indicaron que se secretaron trazas de materiales de ADN en el medio de cultivo durante el desarrollo embrionario, y se han realizado esfuerzos para realizar un cribado cromosómico completo (CCS) utilizando el medio de cultivo de embriones gastados 14,15,16,17,18. Sin embargo, las tasas de detección y la precisión de las pruebas no han cumplido con los requisitos para un uso clínico extensivo. El presente estudio reportó una mejoría en el ensayo NICS para aumentar las tasas de detección, así como la precisión de la prueba NICS19. En los últimos años, el líquido blastocelele (BF) se ha estudiado como una muestra analítica de PGT-A mínimamente invasiva. Sin embargo, la proporción de amplificación exitosa de todo el genoma y ADN detectable en muestras de líquido blastocisto oscila entre el 34,8% y el 82%20,21,22. El volumen de LM reportado en varios estudios oscila entre 0,3 nL y 1 μL. En vista de la baja cantidad de ADN en BF, es posible aumentar la cantidad de ADN libre de células mezclando líquido de blastocisto y medio de cultivo para mejorar la tasa de éxito y la consistencia de la detección. Kuznyetsov y cols.23 y Li et al.24 trataron la zona pelúcida con un láser y liberaron líquido blastocisto en el medio de cultivo para mejorar la cantidad total de ADN embrionario, y la tasa de amplificación de las muestras combinadas de medio/BF después de WGA fue del 100% y del 97,5%, respectivamente. Jiao et al.25 también obtuvieron una tasa de éxito de amplificación del 100% utilizando el mismo método.

El presente estudio reporta un protocolo detallado que incluye la preparación de la muestra de medios gastados, la preparación de NGS y el análisis de datos. Mediante la extracción cuidadosa de células cúmulos de ovocitos, el presente estudio realizó una inyección intracitoplasmática de espermatozoides únicos (ICSI) y un cultivo de blastocisto. El medio gastado del día 4 al día 5 y al día 6 se recolectó para la preparación de la biblioteca WGA y NGS. Mediante el uso de la tecnología NICS, el presente estudio agilizó los pasos de preparación de la biblioteca WGA y NGS en aproximadamente 3 h y obtuvo resultados de CCS de forma no invasiva en aproximadamente 9 h.

Protocol

Se obtuvo el permiso ético del Comité de Ética del Tercer Hospital de la Universidad de Pekín. 1. Preparación NOTA: Los materiales y equipos necesarios se enumeran en la Tabla de materiales. ReactivosPrecalentar y equilibrar (equilibrado) 20-30 μL de medio de gametos/medio de fertilización y medio de cultivo de escisión/blastocisto (cubierto con aceite mineral) e hialuronidasa (en un tubo bien tapado) a 37 °C, 5% de CO<sub…

Representative Results

En el presente estudio se aplicó el método propuesto a un paciente. Se obtuvo la aprobación del IRB y el consentimiento informado antes de la aplicación del análisis NICS. En el presente estudio se obtuvieron 6 blastocistos de pacientes y se realizó NICS en los 6 embriones en el medio día 4 a día 5. Las anomalías cromosómicas causadas por la translocación equilibrada de los padres se detectaron en cinco de los cromosomas con el ensayo NICS; por lo tanto, no se podían utilizar para la transferencia (<strong cl…

Discussion

Modificaciones y solución de problemas

Si los resultados de la NICS están contaminados con materiales genéticos parentales, asegúrese de que se eliminen todas las células del cúmulo radiata de la corona y de que se realice la ICSI para la fertilización. Se evitan los procesos inadecuados de almacenamiento en el medio o de preparación de plantillas, que pueden degradar el ADN. El espacio de trabajo se purificó a fondo con reactivos de descontaminación de DNasa y RNasa…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores desean agradecer a Shiping Bo y Shujie Ma por su ayuda en el análisis de datos de NGS. Financiamiento: este trabajo fue apoyado por el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave (Subvención No. 2018YFC1003100).

Materials

1.5 mL EP tube, 0.2 mL PCR tube Axygen MCT-150-C, PCR-02-C DNase/RNase free, Low Binding PCR tubes and 1.5 mL micro-centrifuge tubes are recommended.
10 µL, 200 µL, 1000 µL DNase /RNase Free Tips Axygen T-300-R-S, T-200-Y-R-S, T-1000-B-R-S This can be replaced by other brand/For sample transfer
100 % ethanol Sinopharm Chemical 10009218 This can be replaced by other brand/For DNA library purification
Barcode Primer1-48 Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit For library amplificaton
BD Falcon Organ Culture Dish, Sterile BD Bioscience 363037 This can be replaced by other brand/For embryo culture
BD Falcon Tissue culture Dishes (Easy Grip) , Sterile BD Bioscience 353001 This can be replaced by other brand/For embryo culture
BD Falcon Tissue culture Dishes, Sterile BD Bioscience 353002 This can be replaced by other brand/For embryo culture
Cell Lysis Buffer Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit For culture medium pre-treatment
Cell Lysis Enzyme Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit For culture medium pre-treatment
ChromGo software Yikon Genomics Data analysis
CMPure Magbeads Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit For library purification
Cryotop open systerm  KITAZATO BioPharma 81110 This can be replaced by other brand/For embryo vitrification
Distill water Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit To dissolve DNA
ES (Vitrification kit)  KITAZATO BioPharma Reagent inVitrification kit This can be replaced by other brand/For embryo vitrification
HOLDNIG ORIGIO MPH-MED-35 This can be replaced by other
brand/For ICSI
Hyaluronidase solution, 80 U/mL SAGE ART4007-A This can be replaced by other brand/Digest oocyte-corona-cumulus complex
ICSI ORIGIO MPH-35-35 This can be replaced by other brand/For ICSI
Illumina MiSeq® System Illumina SY-410-1001 For library sequencing
Incubator Labotect Inkubator C16 This can be replaced by other brand/For embryo culture
Library buffer Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit For library amplificaton
Library Enzyme Mix Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit For library amplificaton
Magnetic Stand DynaMagTM-2 12321D For library purification
Microscope OLYMPUS 1X71 This can be replaced by other brand/For embryo observation
Mini-centrifuge ESSENSCIEN ELF6 For separation
MT Enzyme Mix Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit For culture medium pre-treatment
NICSInst library preparation kit Yikon Genomics KT1000800324 Whole genome amplification and library construction
NICSInst Sample Prep Station Yikon Genomics  ME1001003 Amplificate DNA
Nunc IVF 4-Well Dish Thermo Scientific 144444 This can be replaced by other brand/For embryo washing and blastocyst culture
Pasteur Pipette Oirgio  MXL3-IND-135 This can be replaced by other brand/For embryo tansfer
Pasteur pipettes ORIGIO PP-9-1000 This can be replaced by other brand/For IVF laboratory
Pre-Lib Buffer Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit Pre-library preparation
Pre-Lib Enzyme Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit Pre-library preparation
Qubit® 3.0 Fluorometer Thermo Scientific Q33216 For library quantification
Quinn's Advantage Blastocyst Medium SAGE ART-1029 For embryo blastocyst stage culture
Quinn's Advantage Cleavage Medium SAGE ART-1026 This can be replaced by other brand/For embryo cleavage stage culture
Quinn's Advantage Fertilization Medium SAGE ART-1020 This can be replaced by other brand/For oocyte and sperm fertilization
Quinn's Advantage m-HTF Medium with HEPES SAGE ART-1023 This can be replaced by other brand/For embryo clutrure
Quinn's Advantage SPS Serum protein Substitute Kit SAGE ART-3010 This can be replaced by other brand/To denude the oocyte
Quinn's Advantage Tissue culture mineral oil SAGE ART-4008P This can be replaced by other brand/To cover the culture medium
STRIPPER TIPS ORIGIO MXL3-IND-135 This can be replaced by other brand/For denudating granulosa cells
Vitrification Cryotop Open systerm KIZTAZATO 81111 This can be replaced by other brand/For embryo vitrification
Vitrification kit  KITAZATO BioPharma VT101 This can be replaced by other brand/For embryo vitrification
Vortexer Qilinbeier DNYS8 Sample mix
VS (Vitrification kit)  KITAZATO BioPharma Reagent inVitrification kit This can be replaced by other brand/For embryo vitrification
ZILOS-tk Laser System Hamilton Thorne CLASS 1 laser This can be replaced by other brand/For artificial blastocoele collapse

References

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Citer Cet Article
Huang, J., Yao, Y., Jia, J., Zhu, X., Ma, J., Wang, J., Liu, P., Lu, S. Chromosome Screening of Human Preimplantation Embryos by Using Spent Culture Medium: Sample Collection and Chromosomal Ploidy Analysis. J. Vis. Exp. (175), e62619, doi:10.3791/62619 (2021).

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