Chromosoomscreening van menselijke pre-implantatie-embryo's met behulp van gebruikt kweekmedium: monsterafname en chromosomale ploïdieanalyse
Summary
De huidige studie rapporteert een protocol voor chromosoomscreening van menselijke embryo’s waarbij gebruik wordt gemaakt van gebruikt kweekmedium, waardoor embryobiopsie wordt vermeden en chromosoomploïdie-identificatie met behulp van NGS mogelijk wordt. Het huidige artikel presenteert de gedetailleerde procedure, inclusief de voorbereiding van kweekmedium, whole genome amplification (WGA), next-generation sequencing (NGS) bibliotheekvoorbereiding en data-analyse.
Abstract
Bij klinische in-vitrofertilisatie (IVF) vereist de heersende methode voor PGT-A een biopsie van enkele cellen uit het trophectoderm (TE). Dit is de afstammingslijn die de placenta vormt. Deze methode vereist echter gespecialiseerde vaardigheden, is invasief en lijdt aan valse positieven en negatieven omdat het aantal chromosomen in de TE en de binnenste celmassa (ICM), die zich ontwikkelt tot de foetus, niet altijd hetzelfde zijn. NICS, een technologie die sequencing vereist van DNA dat vrijkomt in het kweekmedium van zowel TE als ICM, kan een uitweg bieden voor deze problemen, maar het is eerder aangetoond dat het een beperkte werkzaamheid heeft. De huidige studie rapporteert het volledige protocol van NICS, dat bemonsteringsmethoden voor kweekmediums, amplificatie van het hele genoom (WGA) en bibliotheekvoorbereiding omvat, en NGS-gegevensanalyse door analysesoftware. Gezien de verschillende cryopreservatietijden in verschillende embryolaboratoria, hebben embryologen twee methoden voor het verzamelen van embryokweekmedium die kunnen worden geselecteerd op basis van de werkelijke omstandigheden van het IVF-laboratorium.
Introduction
Geassisteerde voortplantingstechnologieën (ART’s) worden steeds vaker gebruikt voor de behandeling van onvruchtbaarheid. Het slagingspercentage van ART, zoals IVF, is echter beperkt en het zwangerschapsverliespercentage is aanzienlijk hoger dan dat van de normale populatie1. De belangrijkste oorzaak van deze problemen zijn chromosomale afwijkingen, die vaak voorkomen in pre-implantatie menselijke embryo’s2. PGT-A is een effectieve methode om embryo’s te screenen op chromosomale balans vóór implantatie 3,4. Sommige onderzoeken hebben aangetoond dat PGT-A het aantal abortussen kan verminderen en het aantal zwangerschappen kan verbeteren 5,6,7,8. PGT-A vereist echter complexe technische expertise die specifieke training en ervaring vereist. De invasieve embryobiopsieprocedure kan mogelijk ook schade aan de embryo’s veroorzaken9. Studies hebben aangetoond dat blastomeerbiopsie de latere ontwikkeling kan belemmeren en dat het aantal biopsieën van TE’s de implantatiesnelheden kan beïnvloeden10. Hoewel het bioveiligheidsprobleem op lange termijn van embryobiopsie nog niet grondig is geëvalueerd bij mensen, hebben dierstudies aangetoond dat het een negatieve invloed heeft op de ontwikkeling van embryo’s11,12,13.
Eerdere rapporten gaven aan dat sporen van DNA-materiaal werden uitgescheiden in het kweekmedium tijdens de ontwikkeling van het embryo, en er zijn inspanningen geleverd om uitgebreide chromosoomscreening (CCS) uit te voeren met behulp van gebruikt embryocultuurmedium 14,15,16,17,18. De detectiepercentages en de nauwkeurigheid van de tests voldeden echter niet aan de vereisten voor uitgebreid klinisch gebruik. De huidige studie rapporteerde een verbetering in de NICS-test voor het verhogen van de detectiepercentages en de nauwkeurigheid van de NICS-test19. In de afgelopen jaren is blastocoelevloeistof (BF) bestudeerd als een analytisch monster van minimaal invasieve PGT-A. Het aandeel van succesvolle genoombrede amplificatie en detecteerbaar DNA in blastocystvloeistofmonsters varieert echter van 34,8% tot 82%20,21,22. Het volume BF dat in verschillende onderzoeken wordt gerapporteerd, varieert van 0,3 nL tot 1 μL. Gezien de lage hoeveelheid DNA in BF is het mogelijk om de hoeveelheid celvrij DNA te verhogen door blastocystvloeistof en kweekmedium te mengen om het slagingspercentage en de consistentie van de detectie te verbeteren. Kuznyetsov et al.23 en Li et al.24 behandelden de zona pellucida met een laser en gaven blastocystvloeistof af in het kweekmedium om de totale hoeveelheid embryonaal DNA te verbeteren, en de amplificatiesnelheid van het gecombineerde medium/BF-monsters na WGA was respectievelijk 100% en 97,5%. Jiao et al.25 verkregen ook een slagingspercentage van 100% door dezelfde methode te gebruiken.
De huidige studie rapporteert een gedetailleerd protocol dat de voorbereiding van gebruikte mediamonsters, NGS-voorbereiding en gegevensanalyse omvat. Door zorgvuldig cumuluscellen uit eicellen te verwijderen, voerde de huidige studie intracytoplasmatische enkelvoudige sperma-injectie (ICSI) en blastocystkweek uit. Het medium van dag 4 – dag 5 / dag 6 werd verzameld voor de voorbereiding van de WGA- en NGS-bibliotheek. Door gebruik te maken van NICS-technologie stroomlijnde de huidige studie de voorbereidingsstappen van de WGA- en NGS-bibliotheek in ongeveer 3 uur en verkreeg het niet-invasieve CCS-resultaten in ongeveer 9 uur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wijzigingen en probleemoplossing
Als de NICS-resultaten besmet zijn met ouderlijk genetisch materiaal, zorg er dan voor dat alle cumulus-corona radiata-cellen worden verwijderd en zorg ervoor dat ICSI wordt uitgevoerd voor bevruchting. Onjuiste mediumopslag of sjabloonvoorbereidingsprocessen worden vermeden, waardoor DNA kan worden afgebroken. De werkruimte werd grondig gezuiverd met DNase- en RNase-decontaminatiereagentia. Om besmetting door andere embryo’s te voorkomen, werd…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen Shiping Bo en Shujie Ma bedanken voor hun hulp bij de analyse van NGS-gegevens. Financiering: dit werk werd ondersteund door het National Key Research and Development Program (subsidienr. 2018YFC1003100).
Materials
| 1.5 mL EP tube, 0.2 mL PCR tube | Axygen | MCT-150-C, PCR-02-C | DNase/RNase free, Low Binding PCR tubes and 1.5 mL micro-centrifuge tubes are recommended. |
| 10 µL, 200 µL, 1000 µL DNase /RNase Free Tips | Axygen | T-300-R-S, T-200-Y-R-S, T-1000-B-R-S | This can be replaced by other brand/For sample transfer |
| 100 % ethanol | Sinopharm Chemical | 10009218 | This can be replaced by other brand/For DNA library purification |
| Barcode Primer1-48 | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | For library amplificaton |
| BD Falcon Organ Culture Dish, Sterile | BD Bioscience | 363037 | This can be replaced by other brand/For embryo culture |
| BD Falcon Tissue culture Dishes (Easy Grip) , Sterile | BD Bioscience | 353001 | This can be replaced by other brand/For embryo culture |
| BD Falcon Tissue culture Dishes, Sterile | BD Bioscience | 353002 | This can be replaced by other brand/For embryo culture |
| Cell Lysis Buffer | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | For culture medium pre-treatment |
| Cell Lysis Enzyme | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | For culture medium pre-treatment |
| ChromGo software | Yikon Genomics | Data analysis | |
| CMPure Magbeads | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | For library purification |
| Cryotop open systerm | KITAZATO BioPharma | 81110 | This can be replaced by other brand/For embryo vitrification |
| Distill water | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | To dissolve DNA |
| ES (Vitrification kit) | KITAZATO BioPharma | Reagent inVitrification kit | This can be replaced by other brand/For embryo vitrification |
| HOLDNIG | ORIGIO | MPH-MED-35 | This can be replaced by other brand/For ICSI |
| Hyaluronidase solution, 80 U/mL | SAGE | ART4007-A | This can be replaced by other brand/Digest oocyte-corona-cumulus complex |
| ICSI | ORIGIO | MPH-35-35 | This can be replaced by other brand/For ICSI |
| Illumina MiSeq® System | Illumina | SY-410-1001 | For library sequencing |
| Incubator | Labotect | Inkubator C16 | This can be replaced by other brand/For embryo culture |
| Library buffer | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | For library amplificaton |
| Library Enzyme Mix | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | For library amplificaton |
| Magnetic Stand | DynaMagTM-2 | 12321D | For library purification |
| Microscope | OLYMPUS | 1X71 | This can be replaced by other brand/For embryo observation |
| Mini-centrifuge | ESSENSCIEN | ELF6 | For separation |
| MT Enzyme Mix | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | For culture medium pre-treatment |
| NICSInst library preparation kit | Yikon Genomics | KT1000800324 | Whole genome amplification and library construction |
| NICSInst Sample Prep Station | Yikon Genomics | ME1001003 | Amplificate DNA |
| Nunc IVF 4-Well Dish | Thermo Scientific | 144444 | This can be replaced by other brand/For embryo washing and blastocyst culture |
| Pasteur Pipette | Oirgio | MXL3-IND-135 | This can be replaced by other brand/For embryo tansfer |
| Pasteur pipettes | ORIGIO | PP-9-1000 | This can be replaced by other brand/For IVF laboratory |
| Pre-Lib Buffer | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | Pre-library preparation |
| Pre-Lib Enzyme | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | Pre-library preparation |
| Qubit® 3.0 Fluorometer | Thermo Scientific | Q33216 | For library quantification |
| Quinn's Advantage Blastocyst Medium | SAGE | ART-1029 | For embryo blastocyst stage culture |
| Quinn's Advantage Cleavage Medium | SAGE | ART-1026 | This can be replaced by other brand/For embryo cleavage stage culture |
| Quinn's Advantage Fertilization Medium | SAGE | ART-1020 | This can be replaced by other brand/For oocyte and sperm fertilization |
| Quinn's Advantage m-HTF Medium with HEPES | SAGE | ART-1023 | This can be replaced by other brand/For embryo clutrure |
| Quinn's Advantage SPS Serum protein Substitute Kit | SAGE | ART-3010 | This can be replaced by other brand/To denude the oocyte |
| Quinn's Advantage Tissue culture mineral oil | SAGE | ART-4008P | This can be replaced by other brand/To cover the culture medium |
| STRIPPER TIPS | ORIGIO | MXL3-IND-135 | This can be replaced by other brand/For denudating granulosa cells |
| Vitrification Cryotop Open systerm | KIZTAZATO | 81111 | This can be replaced by other brand/For embryo vitrification |
| Vitrification kit | KITAZATO BioPharma | VT101 | This can be replaced by other brand/For embryo vitrification |
| Vortexer | Qilinbeier | DNYS8 | Sample mix |
| VS (Vitrification kit) | KITAZATO BioPharma | Reagent inVitrification kit | This can be replaced by other brand/For embryo vitrification |
| ZILOS-tk Laser System | Hamilton Thorne | CLASS 1 laser | This can be replaced by other brand/For artificial blastocoele collapse |
References
- Barlow, P. Early pregnancy loss and obstetrical risk after in-vitro fertilization and embryo replacement. Human Reproduction. 3 (5), 671-675 (1988).
- Munne, S. Chromosome abnormalities and their relationship to morphology and development of human embryos. Reproductive BioMedicine Online. 12 (2), 234-253 (2006).
- Harton, G. L. Diminished effect of maternal age on implantation after preimplantation genetic diagnosis with array comparative genomic hybridization. Fertility and Sterility. 100 (6), 1695-1703 (2013).
- Hodes-Wertz, B. Idiopathic recurrent miscarriage is caused mostly by aneuploid embryos. Fertility and Sterility. 98 (3), 675-680 (2012).
- Keltz, M. D. Preimplantation genetic screening (PGS) with Comparative genomic hybridization (CGH) following day 3 single cell blastomere biopsy markedly improves IVF outcomes while lowering multiple pregnancies and miscarriages. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (10), 1333-1339 (2013).
- Scott, R. T. Blastocyst biopsy with comprehensive chromosome screening and fresh embryo transfer significantly increases in vitro fertilization implantation and delivery rates: a randomized controlled trial. Fertility and Sterility. 100 (3), 697-703 (2013).
- Forman, E. J. In vitro fertilization with single euploid blastocyst transfer: a randomized controlled trial. Fertility and Sterility. 100 (1), 100-107 (2013).
- Yang, Z. Selection of single blastocysts for fresh transfer via standard morphology assessment alone and with array CGH for good prognosis IVF patients: results from a randomized pilot study. Molecular Cytogenetics. 5 (1), 24 (2012).
- Cimadomo, D. The Impact of Biopsy on Human Embryo Developmental Potential during Preimplantation Genetic Diagnosis. BioMed Research International. 2016, 7193075 (2016).
- Scott, R. T., Upham, K. M., Forman, E. J., Zhao, T., Treff, N. R. Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial. Fertility and Sterility. 100 (3), 624-630 (2013).
- Wu, Y. Blastomere biopsy influences epigenetic reprogramming during early embryo development, which impacts neural development and function in resulting mice. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (9), 1761-1774 (2014).
- Zhao, H. C. Aberrant epigenetic modification in murine brain tissues of offspring from preimplantation genetic diagnosis blastomere biopsies. Biology of Reproduction. 89 (5), 117 (2013).
- Zeng, Y. Preimplantation genetic diagnosis (PGD) influences adrenal development and response to cold stress in resulting mice. Cell and Tissue Research. 354 (3), 729-741 (2013).
- Palini, S. Genomic DNA in human blastocoele fluid. Reproductive BioMedicine Online. 26 (6), 603-610 (2013).
- Gianaroli, L. Blastocentesis: a source of DNA for preimplantation genetic testing. Results from a pilot study. Fertility and Sterility. 102 (6), 1692-1699 (2014).
- Stigliani, S., Anserini, P., Venturini, P. L., Scaruffi, P. Mitochondrial DNA content in embryo culture medium is significantly associated with human embryo fragmentation. Human Reproduction. 28 (10), 2652-2660 (2013).
- Stigliani, S. Mitochondrial DNA in Day 3 embryo culture medium is a novel, non-invasive biomarker of blastocyst potential and implantation outcome. Molecular Human Reproduction. 20 (12), 1238-1246 (2014).
- Wu, H. Medium-Based Noninvasive Preimplantation Genetic Diagnosis for Human α-Thalassemias-SEA. Médecine. 94 (12), e669 (2015).
- Xu, J. Noninvasive chromosome screening of human embryos by genome sequencing of embryo culture medium for in vitro fertilization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (42), 11907-11912 (2016).
- Capalbo, A. Diagnostic efficacy of blastocoel fluid and spent media as sources of DNA for preimplantation genetic testing in standard clinical conditions. Fertility and Sterility. 110 (5), 870-879 (2018).
- Tobler, K. J. Blastocoel fluid from differentiated blastocysts harbors embryonic genomic material capable of a whole-genome deoxyribonucleic acid amplification and comprehensive chromosome microarray analysis. Fertility and Sterility. 104 (2), 418-425 (2015).
- Magli, M. C. Preimplantation genetic testing: polar bodies, blastomeres, trophectoderm cells, or blastocoelic fluid?. Fertility and Sterility. 105 (3), 676-683 (2016).
- Kuznyetsov, V. Evaluation of a novel non-invasive preimplantation genetic screening approach. PLoS One. 13 (5), e0197262 (2018).
- Li, P. Preimplantation Genetic Screening with Spent Culture Medium/Blastocoel Fluid for in Vitro Fertilization. Scientific Reports. 8 (1), 9275 (2018).
- Jiao, J. Minimally invasive preimplantation genetic testing using blastocyst culture medium. Human Reproduction. 34 (7), 1369-1379 (2019).
- Palermo, G. D. Births after intracytoplasmic injection of sperm obtained by testicular extraction from men with nonmosaic Klinefelter’s syndrome. New England Journal of Medicine. 338 (9), 588-590 (1998).
- Alpha Scientists in Reproductive, M., & Embryology, E. S. I. G. o. The Istanbul consensus workshop on embryo assessment: proceedings of an expert meeting. Human Reproduction. 26 (6), 1270-1283 (2011).
- . Qubit dsDNA HS Assay Kit Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q32851?ICID=search-product (2015)
- . Miseq system use guide Available from: https://support.illumina.com/downloads/miseq_system (2016)
- Lane, M. Ability to detect aneuploidy from cell free DNA collected from media is dependent on the stage of development of the embryo. Fertility and Sterility. 108 (3), (2017).
- Rubio, C. Multicenter prospective study of concordance between embryonic cell-free DNA and trophectoderm biopsies from 1301 human blastocysts. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 223 (5), 751-751 (2020).
- Rubio, C. Embryonic cell-free DNA versus trophectoderm biopsy for aneuploidy testing: concordance rate and clinical implications. Fertility and Sterility. 112 (3), 510-519 (2019).
- Lledo, B. Consistent results of non-invasive PGT-A of human embryos using two different techniques for chromosomal analysis. Reproductive BioMedicine Online. 42 (3), 555-563 (2021).
- Kuznyetsov, V. Minimally Invasive Cell-Free Human Embryo Aneuploidy Testing (miPGT-A) Utilizing Combined Spent Embryo Culture Medium and Blastocoel Fluid -Towards Development of a Clinical Assay. Scientific Reports. 10 (1), 7244 (2020).
