Como implementado atualmente, a optogenética em primatas não humanos requer injeção de vetores virais no cérebro. Um método de injeção ideal deve ser confiável e, para muitas aplicações, capaz de atingir locais individuais de profundidade arbitrária que são facilmente e inequivocamente identificados na histologia pós-morte. Um método de injeção com essas propriedades é apresentado.
Técnicas optogenéticas revolucionaram a pesquisa em neurociência e estão prontas para fazer o mesmo para terapia genética neurológica. O uso clínico da optogenética, no entanto, exige que a segurança e a eficácia sejam demonstradas em modelos animais, idealmente em primatas não humanos (NHPs), devido à sua semelhança neurológica com os seres humanos. O número de vetores candidatos que são potencialmente úteis para neurociência e medicina é vasto, e nenhum meio de alta produtividade para testar esses vetores ainda existe. Assim, há a necessidade de técnicas para fazer múltiplas injeções espacial e volutricicamente precisas de vetores virais no cérebro de NHP que podem ser identificados inequivocamente através da histologia pós-morte. Descrito aqui é tal método. As cânulas de injeção são construídas acoplados a partir de tubos de politefluoroetileno acoplado e de aço inoxidável. Essas cânulas são autoclaváveis, descartáveis e têm baixos volumes de carregamento mínimo, tornando-as ideais para a injeção de soluções de vetores virais caros e altamente concentrados. Um óleo mineral inerte e tingido vermelho preenche o espaço morto e forma um menisco visível com a solução vetorial, permitindo uma medição instantânea e precisa das taxas de injeção e volumes. O óleo é carregado na parte traseira da cânula, reduzindo o risco de co-injeção com o vetor. As cânulas podem ser carregadas em 10 minutos, e as injeções podem ser feitas em 20 minutos. Este procedimento é bem adequado para injeções em animais acordados ou anestesiados. Quando usado para fornecer vetores virais de alta qualidade, este procedimento pode produzir uma expressão robusta de proteínas optogenéticas, permitindo o controle óptico da atividade neural e do comportamento em NHPs.
A optogenética em primatas não humanos (NHPs) normalmente envolve a injeção de vetor viral diretamente no cérebro. Uma classe de vetores que é bem adequado para esta aplicação é baseada no vírus associado ao Adeno (AAV). Esses vetores consistem em um capsídeo proteico em torno de um genoma de DNA de uma única cadeia que, por sua vez, consiste em um promotor, um gene opsin, e opcionalmente, outros elementos de codificação de proteínas e normas genéticas. Os avanços na clonagem molecular facilitaram a manipulação e combinação desses componentes para o desenvolvimento de novos vetores. Consequentemente, a coleção de vetores AAV que é potencialmente útil para a optogenética NHP é grande e cresce rapidamente.
Atualmente, a utilidade de um vetor AAV para optogenética NHP requer testes in vivo. Este fato é uma barreira substancial para o progresso. Os animais devem ser usados com moderação, e testar vários vetores em um único animal requer que os locais de injeção sejam posicionados criteriosamente em relação à arquitetura neural e bem separados em relação à propagação viral. A avaliação histológica precisa requer que as injeções sejam espacialmente e volutricicamente precisas. Uma técnica de injeção anteriormente utilizada para a entrega focal de agentes farmacológicos 1,2,3,4 foi adaptada e simplificada para fazer tais injeções. Esta técnica de injeção é barata, usa componentes descartáveis e esterilizáveis, pode ser usada em macacos anestoetizados ou acordados, e pode ser usada para atingir diversas áreas cerebrais de qualquer profundidade. O protocolo a seguir descreve procedimentos passo a passo para fabricar os componentes descartáveis e fazer injeções no cérebro NHP. As vantagens e desvantagens da técnica são discutidas.
Os avanços da optogenética NHP criaram a necessidade de métodos precisos e confiáveis de injeção intracraniana. As vantagens do método descrito neste relatório são que ele é barato, usa componentes esterilizados e descartáveis, e tem a capacidade de atingir diversas áreas cerebrais de qualquer profundidade. Também permite o controle da velocidade e volume de injeção em virtude da velocidade com que a válvula de ar pode ser controlada. A pressão do ar pode ser aumentada transitoriamente para desalojar um entupimento e, em seguida, reduzida rapidamente para evitar a subsequente sobre-injeção que seria produzida por pressão sustentada. Componentes descartáveis reduzem o risco de contaminação cruzada entre locais de injeção.
Passos críticos neste protocolo de injeção incluem a construção de cânulas de alta qualidade, o carregamento delas sem introduzir bolhas e selecionar locais de injeção que não estejam muito próximos. As injeções ≥1 cm de distância geralmente transduzem regiões não sobrepostas, mas essa heurística depende de sorotipo viral, titer, promotor, volume, alvo e método de detecção. A seleção de locais de injeção que não estão diretamente conectados evita potenciais confusões produzidas pelo tráfico de opsina ao longo dos axônios e a propensão de alguns sorotipos AAV para transdução retrógrada.
O método pode ser usado para injetar NHPs enquanto anestesiado e em um quadro estereotaxista (Figura 3) ou alerta e cabeça fixa (Figura 4). O primeiro tem a vantagem de permitir que as injeções sejam direcionadas em coordenadas estereotribuíficas, e permite a confirmação visual da penetração de cânula através de uma duratomia aguda (incisar a dura em um macaco acordado, através de uma craniotomia crônica, eleva o risco de infecção). Esta última abordagem tem as vantagens de reduzir o número de cirurgias de sobrevivência e, portanto, o estresse para o animal, ser compatível com registros eletrofisiológicos durante o comportamento, e utilizar o mesmo quadro de coordenadas e instrumentação usado para inserir fibras ópticas para experimentos pós-injeção. A técnica de injeção em macacos acordados poderia ser melhorada fazendo injeções através de dura artificial 13,14,15. Isso conferiria as vantagens adicionais da visualização direta dos locais de injeção e da fluorescência tecidual que indica uma transdução bem sucedida.
Várias outras técnicas de injeção de AAV têm sido usadas em NHPs. Recentemente, um dispositivo de injeção multicanal foi desenvolvido para fornecer vetores AAV uniformemente para grandes regiões corticais NHP16. Resultados semelhantes podem ser obtidos utilizando-se uma entrega aprimorada de convecção17,18. Esses métodos visam maximizar a disseminação da transdução, que é um objetivo importante, mas que é distinto da precisão espacial que nosso método pretende alcançar.
Outro método alternativo é injetar vetores AAV através de tubos de borossilicato que são chanfrados a uma ponta afiada em uma extremidade e anexados a uma seringa Hamilton na outra 5,6. Este método tem muito em comum com o método descrito neste artigo. O vetor viral é mantido em um comprimento de tubulação, o espaço na tubulação atrás do vírus é preenchido com óleo tingido, e o fluxo do vetor é monitorado através do movimento do menisco vetorial de óleo. Esta técnica alternativa requer menos equipamentos e preparação, mas requer o desenho de óleo na tubulação de borossilicato através da ponta chanfrada por pressão negativa e carregar o vetor através da mesma rota posteriormente. Isso inevitavelmente resulta em vestígios de óleo entregues ao cérebro. Além disso, em nossa experiência, a tubulação de borossilicato deve ter um diâmetro de ~350 μm para penetrar dura mesmo quando chanfrada e, portanto, causar maior dano mecânico do que a cânula metálica mais fina descrita neste artigo (Figura 2D). A tubulação de 30 G foi usada porque sua carga crítica de fivela é alta o suficiente para mediar a penetração de dura, apesar de um comprimento de 1-10 cm, porque se encaixa firmemente na tubulação PTFE, e porque raramente fica obstruída. 33 G de tubulação entope e dobra mais facilmente e é mais difícil de acasalar com a tubulação PTFE. A tubulação de 36 G é insuficientemente rígida para penetrar nhp dura mater.
Outra técnica alternativa de injeção é acasalar a saída da bomba de ar para uma parte de trás de uma pipeta de vidro puxado e carregada de vetores19. O vetor é forçado a sair da ponta da pipeta por pressão de ar direta e intermitente da bomba, eliminando a necessidade de óleo. Semelhante ao método de tubo único explicado acima, a falta de junções materiais entre o menisco e a ponta da cânula reduz o risco de vazamentos. No entanto, o afunilamento afiado e as delicadas pontas de pipetas de vidro impedem que penetrem na dura NHP ou direvam estruturas profundas.
The authors have nothing to disclose.
Este estudo foi apoiado por WaNPRC/ITHS P51OD010425 (JTT), Instituto Nacional de Saúde (NIH) concede bolsas EY023277 (R01 para YK), EY030441 (R01 para GH), MH114126 (RF1 a JTT, Boaz Levi, Ed Lein), MH120095 (UG3 para JTT e GH), EY028902 (R01 para RS), e viabilizado pelas bolsas NIH OD010425 (P51 para WaNPRC) e Fundo de Pesquisa de Royalties da Universidade de Washington A148416. Os autores gostariam de agradecer Yasmine El-Shamayleh e Victoria Omstead por histologia, Refugio Martinez por clonagem de vetores virais e John Mich por assistência ao processamento de tecido cerebral NHP.
Equipment: Stereotaxic set | |||
Item | |||
Allen keys | BONDHUS | 10936 | STERRAD |
Cannula holder | KOPF | 1770 | STERRAD |
Carrier (manipulator) | KOPF | 1404 | STERRAD |
Carrier platform | KOPF | 1430 | NA |
Carrier stand | KOPF | 1449 | STERRAD |
Eye, ear, mouth bars | KOPF | 1430 | NA |
Stereotaxic base | KOPF | 1210 | NA |
Equipment: Cannula | |||
Item | |||
1 mL Luer-lock syringes | BD | 309628 | NA (sterilized package) |
Cannulas* | (homemade – see below) | NA | steam (autoclave) |
Colored oil** | (homemade – see below) | NA | NA |
Elevator (for tube rack) | Cole-Parmer | UX-08057-10 | STERRAD |
Filter tip | Genesee Scientific | 23-404 | NA (sterilized package) |
Fluorescent microbeads | Lumafluor | R170 | NA |
P20 pipetman | Gilson | FA10003M | NA |
PCR tubes | Olympus Plastics | 22-161 | STERRAD |
Stopcock | Cole-Parmer | 3060004 | STERRAD |
Tube rack | homemade | NA | STERRAD |
Vector solution | (homemade) | NA | NA |
Equipment: Electric air pump set | |||
Item | |||
Electric air pump | World Precision Instruments | PV830 | NA |
Foot pedal | World Precision Instruments | 3260 | NA |
Tube cover | EZ Drape | A400-1000 | NA (sterilized package) |
Equipment: General surgery tools | |||
Item | |||
Beaker | MEDLINE | azlon | STERRAD |
Burrs | STRYKER | 277-10-235 | STERRAD |
Double pronged tissue pick | Fine Science Tools | 18067-11 | STERRAD |
Drapes | MEDLINE | DYNJP3004 | NA (sterilized package) |
Dressing forceps | Miltex | 6-118 | STERRAD |
Drill | STRYKER | Q9R-5400 | NA |
Drill bits | STRYKER | 277-82-87 | STERRAD |
Gauze | MEDLINE | NON26334 | NA (sterilized package) |
Hemostatic mosquito forceps | Miltex | 7-2, 7-4 | STERRAD |
Light handles | SKYTRON | Stellar XL | STERRAD |
Needle hodler | Miltex | 8-2 | STERRAD |
Periosteal elevator | Miltex | 18-1968 | STERRAD |
Rongeurs | Miltex | 17-4800 | STERRAD |
Saline | BAXTER | 2F7122 | STERRAD |
Scalpel | Bard-Parker | 372610 | STERRAD |
Scissors | Miltex | 5-12, 5-114 | STERRAD |
Senn retractors | Miltex | 28065 | STERRAD |
Sterile gloves | MEDLINE | Triumph Micro | NA (sterilized package) |
Suction | medela | 200-4869 | NA |
Suction tip | MEDLINE | DYNDFR12S | NA (sterilized package) |
Suction tube | COVIDEN | 8888301614 | NA (sterilized package) |
Surgical gowns | MEDLINE | DYNJP2002S | NA (sterilized package) |
Surgical pens & ruler | MEDLINE | DYNJSM03 | NA (sterilized package) |
Suture | COVIDEN | SL-635 | NA (sterilized package) |
Tissue forceps | Miltex | 6-114 | STERRAD |
Towel clamps | Miltex | 7-504 | STERRAD |
Wood swabs | MEDLINE | MDS202095 | NA (sterilized package) |
Equipment: *cannulas | |||
Item | |||
Hypodermic needle | EXELINT INTERNATIONAL | 26437 | NA (sterilized package) |
Stainless steel tube | K-TUBE | K30R | NA |
PTFE tube | ZEUS | 216200 | NA |
Equipment: **colored oil | |||
Item | |||
Liquid Candle Dye Concentrate | PremiumCraft | Red/Pink | NA |
Mineral oil | Vi-Jon | S0883 | NA |
STERRAD: low-temperature hydrogen peroxide gas plasma |