현재 시행 된 바와 같이, 인간이 아닌 영장류의 광유전학은 바이러스 벡터를 뇌에 주입해야합니다. 최적의 주입 방법은 신뢰할 수 있어야 하며 많은 응용 분야에서 사후 조직학에서 쉽고 명확하게 식별되는 임의의 깊이의 개별 부위를 표적으로 삼을 수 있어야 합니다. 이러한 특성을 갖는 주입 방법이 제시된다.
광유전학 기술은 신경과학 연구에 혁명을 일으켰으며 신경학적 유전자 치료에서도 동일한 작업을 수행할 준비가 되어 있습니다. 그러나 광유전학의 임상적 사용은 인간과의 신경학적 유사성 때문에 동물 모델, 이상적으로는 비인간 영장류(NHP)에서 안전성과 효능을 입증해야 합니다. 신경 과학 및 의학에 잠재적으로 유용한 후보 벡터의 수는 방대하며 이러한 벡터를 테스트하기위한 고 처리량 수단은 아직 존재하지 않습니다. 따라서, 사후 조직학을 통해 명확하게 확인할 수 있는 NHP 뇌에 바이러스 벡터를 공간적으로나 체적으로 정확하게 여러 번 주사하는 기술이 필요하다. 본원에 기재된 것은 이러한 방법이다. 주입 캐뉼러는 결합 된 폴리 테트라 플루오로 에틸렌과 스테인리스 스틸 튜브로 구성됩니다. 이 캐뉼러는 오토클레이브가 가능하고 일회용이며 최소 로딩량이 적기 때문에 값 비싸고 고농축 바이러스 벡터 용액을 주입하는 데 이상적입니다. 불활성의 적색 염색 미네랄 오일은 죽은 공간을 채우고 벡터 용액으로 눈에 보이는 반월판을 형성하여 주입 속도와 부피를 즉각적이고 정확하게 측정 할 수 있습니다. 오일은 캐뉼라의 뒤쪽에 적재되어 벡터와의 공동 주입 위험을 줄입니다. 캐뉼러는 10 분 안에로드 할 수 있으며 주사는 20 분 안에 할 수 있습니다. 이 절차는 깨어 있거나 마취 된 동물에게 주사하는 데 매우 적합합니다. 고품질 바이러스 벡터를 전달하는 데 사용되는 경우, 이 절차는 광유전 단백질의 강력한 발현을 생성하여 NHP에서 신경 활동 및 행동을 광학적으로 제어할 수 있습니다.
비인간 영장류(NHP)의 광유전학은 일반적으로 바이러스 벡터를 뇌에 직접 주입하는 것을 포함합니다. 이 응용에 매우 적합한 벡터의 한 부류는 아데노-관련 바이러스(AAV)를 기반으로 한다. 이들 벡터는 단일 가닥 DNA 게놈을 둘러싸는 단백질 캡시드로 구성되며, 이 캡시드는 프로모터, 옵신 유전자 및 선택적으로 다른 단백질 코딩 및 유전자 조절 요소로 구성됩니다. 분자 클로닝의 발전은 새로운 벡터의 개발을 위해 이러한 구성 요소의 조작 및 조합을 촉진했습니다. 결과적으로, NHP 광유전학에 잠재적으로 유용한 AAV 벡터의 집합은 방대하고 빠르게 성장하고 있습니다.
현재, NHP 광유전학을 위한 AAV 벡터의 유용성은 생체 내 테스트가 필요합니다. 이 사실은 진보에 상당한 장벽입니다. 동물은 드물게 사용해야하며 단일 동물에서 여러 벡터를 테스트하려면 주사 부위가 신경 구조에 대해 신중하게 배치되고 바이러스 확산에 비해 잘 분리되어야합니다. 정확한 조직학적 평가를 위해서는 주사가 공간적으로나 체적으로 정확해야 합니다. 이전에 약리학 적 제제 1,2,3,4의 국소 전달에 사용 된 주사 기술은 이러한 주사를 만들기 위해 조정되고 단순화되었습니다. 이 주사 기술은 저렴하고 일회용, 살균 가능한 구성 요소를 사용하며 마취 또는 깨어있는 행동 원숭이에 사용할 수 있으며 모든 깊이의 다양한 뇌 영역을 표적으로 삼는 데 사용할 수 있습니다. 다음 프로토콜은 일회용 구성 요소를 제조하고 NHP 뇌에 주사하는 단계별 절차를 설명합니다. 이 기술의 장점과 단점에 대해 설명합니다.
NHP 광유전학의 발전으로 정확하고 신뢰할 수 있는 두개내 주사 방법이 필요하게 되었습니다. 이 보고서에 설명 된 방법의 장점은 저렴하고 살균 가능하고 일회용 구성 요소를 사용하며 모든 깊이의 다양한 뇌 영역을 표적으로 삼을 수 있다는 것입니다. 또한 공기 밸브를 제어할 수 있는 속도로 분사 속도와 부피를 제어할 수 있습니다. 공기 압력을 일시적으로 증가시켜 막힘을 제거한 다음 지속적인 압력으로 인해 생성되는 후속 과다 주입을 방지하기 위해 빠르게 줄일 수 있습니다. 일회용 구성 요소는 주사 부위 간의 교차 오염 위험을 줄입니다.
이 주입 프로토콜의 중요한 단계에는 고품질 캐뉼라를 구성하고, 기포를 도입하지 않고 로드하고, 서로 너무 가깝지 않은 주입 부위를 선택하는 것이 포함됩니다. ≥1cm 간격으로 주사하는 것은 일반적으로 겹치지 않는 영역을 형질도입하지만 이 휴리스틱은 바이러스 혈청형, 역가, 프로모터, 부피, 표적 및 검출 방법에 따라 달라집니다. 직접 연결되지 않은 주사 부위를 선택하면 축삭을 따라 옵신 트래피킹으로 인해 발생할 수 있는 잠재적인 혼란과 역행 형질도입에 대한 일부 AAV 혈청형의 성향을 피할 수 있습니다.
이 방법은 마취 및 정위 프레임(그림 3) 또는 경고 및 헤드 고정(그림 4)에서 NHP를 주입하는 데 사용할 수 있습니다. 전자는 주사가 정위 좌표를 표적으로 할 수 있다는 장점이 있으며 급성 durotomy를 통해 캐뉼라 침투를 시각적으로 확인할 수 있습니다 (만성 개두술을 통해 깨어있는 원숭이의 경막을 절개하면 감염 위험이 높아집니다). 후자의 접근법은 생존 수술 횟수와 동물에 대한 스트레스를 줄이고, 행동 중 전기 생리 학적 기록과 호환되며, 주입 후 실험을 위해 광섬유를 삽입하는 데 사용되는 것과 동일한 좌표 프레임 및 계측기를 사용하는 장점이 있습니다. 깨어있는 원숭이의 주사 기술은 인공 경막13,14,15를 통해 주사함으로써 더욱 향상 될 수 있습니다. 이것은 주사 부위의 직접 시각화와 성공적인 형질 도입을 나타내는 조직 형광의 추가적인 이점을 부여합니다.
몇몇의 다른 AAV 주입 기술이 NHP에 사용되었다. 최근에, AAV 벡터를 큰 NHP 피질 영역(16)에 균일하게 전달하기 위해 다중-채널 주입 장치가 개발되었다. 유사한 결과가 대류-강화 전달17,18을 사용하여 얻어질 수 있다. 이러한 방법은 형질 도입 확산을 최대화하는 것을 목표로하며, 이는 중요한 목표이지만 우리 방법이 달성하고자하는 공간 정밀도와는 구별됩니다.
또 다른 대안은 한쪽 끝의 날카로운 팁에 비스듬히 기울어지고 다른쪽 5,6의 해밀턴 주사기에 부착된 붕규산 튜브를 통해 AAV 벡터를 주입하는 것입니다. 이 방법은 이 문서에 설명된 방법과 공통점이 많습니다. 바이러스 벡터는 튜빙 길이에 유지되고, 바이러스 뒤의 튜빙 공간은 염색된 오일로 채워지고, 벡터의 흐름은 오일-벡터 메니스커스의 움직임을 통해 모니터링됩니다. 이 대체 기술은 장비와 준비가 덜 필요하지만 음압에 의해 경 사진 팁을 통해 붕규산 튜브로 오일을 흡입하고 이후에 동일한 경로를 통해 벡터를로드해야합니다. 이것은 필연적으로 뇌에 전달되는 미량의 기름을 초래합니다. 또한 우리의 경험에 따르면 붕규산 튜브는 경사가 있어도 경막을 관통하기 위해 ~350μm의 직경을 가져야 하므로 이 백서에 설명된 더 얇은 금속 캐뉼라보다 더 큰 기계적 손상을 일으킵니다(그림 2D). 30G 튜빙은 임계 좌굴 하중이 1-10cm 길이에도 불구하고 경막 침투를 매개할 만큼 충분히 높고, PTFE 튜빙에 단단히 맞고, 거의 막히지 않기 때문에 사용되었습니다. 33G 튜빙은 더 쉽게 막히고 구부러지며 PTFE 튜빙과 결합하기가 더 어렵습니다. 36G 튜빙은 NHP 경막을 관통하기에 충분히 뻣뻣하지 않습니다.
또 다른 대안적인 주입 기술은 공기 펌프의 출력을 벡터-로딩된, 당김-유리 피펫(19)의 후면에 결합시키는 것이다. 벡터는 펌프의 직접적이고 간헐적인 공기 압력에 의해 피펫 팁에서 강제로 나오므로 오일이 필요하지 않습니다. 위에서 설명한 단일 튜브 방법과 유사하게 메 니스 커스와 캐뉼라 팁 사이에 재료 접합부가 없기 때문에 누출 위험이 줄어 듭니다. 그러나 유리 피펫의 날카로운 테이퍼와 섬세한 팁은 NHP 경막을 관통하거나 깊은 구조물을 표적으로 삼는 것을 방지합니다.
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 WaNPRC / ITHS P51OD010425 (JTT), 국립 보건원 (NIH) 보조금 EY023277 (YK의 경우 R01), EY030441 (GH의 경우 R01), MH114126 (RF1에서 JTT, 보아즈 레비, 에드 레인), MH120095 (JTT 및 GH의 경우 UG3), EY028902 (RS의 경우 R01), NIH 보조금 OD010425 (WaNPRC의 경우 P51) 및 워싱턴 대학교 로열티 연구 기금 A148416. 저자는 조직학의 Yasmine El-Shamayleh와 Victoria Omstead, 바이러스 벡터 클로닝의 Refugio Martinez, NHP 뇌 조직 처리에 대한 도움을 준 John Mich에게 감사드립니다.
Equipment: Stereotaxic set | |||
Item | |||
Allen keys | BONDHUS | 10936 | STERRAD |
Cannula holder | KOPF | 1770 | STERRAD |
Carrier (manipulator) | KOPF | 1404 | STERRAD |
Carrier platform | KOPF | 1430 | NA |
Carrier stand | KOPF | 1449 | STERRAD |
Eye, ear, mouth bars | KOPF | 1430 | NA |
Stereotaxic base | KOPF | 1210 | NA |
Equipment: Cannula | |||
Item | |||
1 mL Luer-lock syringes | BD | 309628 | NA (sterilized package) |
Cannulas* | (homemade – see below) | NA | steam (autoclave) |
Colored oil** | (homemade – see below) | NA | NA |
Elevator (for tube rack) | Cole-Parmer | UX-08057-10 | STERRAD |
Filter tip | Genesee Scientific | 23-404 | NA (sterilized package) |
Fluorescent microbeads | Lumafluor | R170 | NA |
P20 pipetman | Gilson | FA10003M | NA |
PCR tubes | Olympus Plastics | 22-161 | STERRAD |
Stopcock | Cole-Parmer | 3060004 | STERRAD |
Tube rack | homemade | NA | STERRAD |
Vector solution | (homemade) | NA | NA |
Equipment: Electric air pump set | |||
Item | |||
Electric air pump | World Precision Instruments | PV830 | NA |
Foot pedal | World Precision Instruments | 3260 | NA |
Tube cover | EZ Drape | A400-1000 | NA (sterilized package) |
Equipment: General surgery tools | |||
Item | |||
Beaker | MEDLINE | azlon | STERRAD |
Burrs | STRYKER | 277-10-235 | STERRAD |
Double pronged tissue pick | Fine Science Tools | 18067-11 | STERRAD |
Drapes | MEDLINE | DYNJP3004 | NA (sterilized package) |
Dressing forceps | Miltex | 6-118 | STERRAD |
Drill | STRYKER | Q9R-5400 | NA |
Drill bits | STRYKER | 277-82-87 | STERRAD |
Gauze | MEDLINE | NON26334 | NA (sterilized package) |
Hemostatic mosquito forceps | Miltex | 7-2, 7-4 | STERRAD |
Light handles | SKYTRON | Stellar XL | STERRAD |
Needle hodler | Miltex | 8-2 | STERRAD |
Periosteal elevator | Miltex | 18-1968 | STERRAD |
Rongeurs | Miltex | 17-4800 | STERRAD |
Saline | BAXTER | 2F7122 | STERRAD |
Scalpel | Bard-Parker | 372610 | STERRAD |
Scissors | Miltex | 5-12, 5-114 | STERRAD |
Senn retractors | Miltex | 28065 | STERRAD |
Sterile gloves | MEDLINE | Triumph Micro | NA (sterilized package) |
Suction | medela | 200-4869 | NA |
Suction tip | MEDLINE | DYNDFR12S | NA (sterilized package) |
Suction tube | COVIDEN | 8888301614 | NA (sterilized package) |
Surgical gowns | MEDLINE | DYNJP2002S | NA (sterilized package) |
Surgical pens & ruler | MEDLINE | DYNJSM03 | NA (sterilized package) |
Suture | COVIDEN | SL-635 | NA (sterilized package) |
Tissue forceps | Miltex | 6-114 | STERRAD |
Towel clamps | Miltex | 7-504 | STERRAD |
Wood swabs | MEDLINE | MDS202095 | NA (sterilized package) |
Equipment: *cannulas | |||
Item | |||
Hypodermic needle | EXELINT INTERNATIONAL | 26437 | NA (sterilized package) |
Stainless steel tube | K-TUBE | K30R | NA |
PTFE tube | ZEUS | 216200 | NA |
Equipment: **colored oil | |||
Item | |||
Liquid Candle Dye Concentrate | PremiumCraft | Red/Pink | NA |
Mineral oil | Vi-Jon | S0883 | NA |
STERRAD: low-temperature hydrogen peroxide gas plasma |