Summary

Un pequeño ARN no codificante MicC contribuye a la virulencia en las proteínas de la membrana externa en Salmonella enteritidis

Published: January 27, 2021
doi:

Summary

Se utilizó un sistema de recombinación mediado por λ-Red para crear un mutante de deleción de un pequeño micC de ARN no codificante.

Abstract

Un ARN pequeño no codificante (ARNs) es un nuevo factor para regular la expresión génica a nivel post-transcripcional. Un tipo de sRNA MicC, conocido en Escherichia coli y Salmonella Typhimurium, podría reprimir la expresión de proteínas de la membrana externa. Para investigar más a fondo la función de regulación de micC en Salmonella Enteritidis, clonamos el gen micC en la cepa 50336 de Salmonella Enteritidis, y luego construimos el mutante 50336Δ micC mediante el sistema de recombinación λ de base roja y el mutante complementario 50336Δ micC/p micC portador del plásmido recombinante pBR322 que expresa micC. Los resultados de qRT-PCR demostraron que la transcripción de ompD en 50336Δ micC fue 1,3 veces mayor que en la cepa de tipo salvaje, mientras que la transcripción de ompA y ompC en 50336Δ micC fue 2,2 veces mayor y 3 veces mayor que la de la cepa de tipo salvaje. Estos indicaron que micC reprime la expresión de ompA y ompC. En el siguiente estudio, la patogenicidad de 50336ΔmicC se detectó infectando ratones Balb/c de 6 semanas de edad y pollos de 1 día de edad. El resultado mostró que la LD 50 de la cepa de tipo salvaje 50336, los mutantes 50336Δ micC y 50336Δ micC / p micC para ratones Balb / c de 6 semanas de edad fueron 12.59 UFC, 5.01 UFC y 19.95 UFC, respectivamente. Las DL 50 de las cepas para pollos de 1 día de edad fueron 1.13 x 109 UFC, 1.55 x 10 8 UFC y2.54 x 10 8 UFC, respectivamente. Indicó que la eliminación de micC aumentaba la virulencia de S. Enteritidis en ratones y pollos mediante la regulación de la expresión de proteínas de la membrana externa.

Introduction

Los ARN pequeños no codificantes (ARNs) tienen una longitud de 40-400 nucleótidos, que generalmente no codifican proteínas, pero podrían transcribirse independientemente en cromosomas bacterianos 1,2,3. La mayoría de los ARNs están codificados en las regiones intergénicas (IGR) entre las regiones codificantes de genes e interactúan con los ARNm diana a través de acciones de apareamiento de bases, y regulan la expresión de genes diana a nivel post-transcripcional 4,5. Desempeñan importantes funciones de regulación en el metabolismo de sustancias, la síntesis de proteínas de la membrana externa, la detección de quórum y la expresión génica de virulencia5.

MicC es un pequeño transcrito de ARN de 109 nucleótidos presente en Escherichia coli y Salmonella enterica serovar Typhimurium, que podría regular la expresión de múltiples proteínas de membrana externa como OmpC, OmpD, OmpN, Omp35 y Omp36 6,7,8,9. MicC regula la expresión de OmpC inhibiendo la unión del ribosoma al ARNm de ompC líder in vitro y requiere la chaperona de ARN Hfq para su función en Escherichia coli6. En Salmonella Typhimurium, MicC silencia el ARNm ompD a través de un ARN dúplex de ≤12 pb dentro de la secuencia codificante (codones 23-26) y luego desestabiliza el ARNm endonucleolítico7. Este proceso de regulación es asistido por la proteína chaperona Hfq10. La OmpC es una proteína abundante de la membrana externa que se pensaba que era importante en ambientes donde las concentraciones de nutrientes y toxinas eran altas, como en el intestino6. La porina OmpD es la proteína de la membrana externa más abundante en Salmonella Typhimurium y representa aproximadamente el 1% de la proteína celular total11. OmpD está implicado en la adhesión a macrófagos humanos y células epiteliales intestinales12. MicC también reprime la expresión de las porinas OmpC y OmpD. Se cree que MicC puede regular la virulencia. Para explorar nuevos genes diana regulados por MicC y estudiar la función de regulación de virulencia de micC, clonamos el gen micC en la cepa 50336 de Salmonella Enteritidis (SE), y luego construimos el mutante 50336ΔmicC y el mutante complementario 50336ΔmicC/p micC. Los nuevos genes diana fueron examinados por qRT-PCR. La virulencia de 50336ΔmicC fue detectada por infecciones de ratones y pollos.

Protocol

Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio del Consejo Nacional de Investigación. El comité de cuidado y uso de animales de la Universidad de Yangzhou aprobó todos los experimentos y procedimientos aplicados a los animales (SYXK2016-0020). 1. Cepas bacterianas, plásmidos y condiciones de cultivo Utilice las bacterias y plásmidos enumerados en la Tabla 1. Cultivar bacterias en caldo LB o…

Representative Results

Construcción del mutante 50336Δ micC y cepa complementada 50336Δ micC /p micC El resultado del clon del gen micC indicó que este gen estaba compuesto por 109 pb mostrando una identidad del 100% con la de S. Typhimurium. Con base en los datos de secuencia, el mutante de deleción 50336ΔmicC y el mutante complementario 50336ΔmicC/p…

Discussion

S. La enteritidis es un importante patógeno intracelular facultativo que puede infectar pollos jóvenes y produce síntomas desde enteritis hasta infección sistémica y muerte17,18. Además, S. enteritidis causa infecciones latentes en pollos adultos y los portadores crónicos contaminan los productos avícolas, lo que resulta en infecciones transmitidas por los alimentos en humanos19. El mecanismo patogénico de S<…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este estudio fue apoyado por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias de China (Nos. 31972651 y 31101826), la Fundación de Ciencias de Educación Superior de Jiangsu (No.14KJB230002), el Laboratorio Estatal Clave de Biotecnología Veterinaria (No.SKLVBF201509), la Subvención de la Fundación de Ciencias de la Naturaleza de Yangzhou (No.YZ2014019), un proyecto financiado por el Desarrollo del Programa Académico Prioritario de las Instituciones de Educación Superior de Jiangsu (PAPD).

Materials

dextrose Sangon Biotech A610219 for broth preparation
DNA purification kit TIANGEN DP214 for DNA purification
Ex Taq TaKaRa RR01A PCR
KH2PO4 Sinopharm Chemical Reagent 10017608 for broth preparation
K2HPO4 Sinopharm Chemical Reagent 20032116 for broth preparation
L-Arabinose Sangon Biotech A610071 λ-Red recombination
Mini Plasmid Kit TIANGEN DP106 plasmid extraction
NaCl Sinopharm Chemical Reagent 10019308 for broth preparation
(NH4)2SO4 Sinopharm Chemical Reagent 10002917 for broth preparation
PrimeScriptRRT reagent Kit with gDNA Eraser  TaKaRa RR047 qRT-PCR
SYBRR Premix Ex Taq II TaKaRa RR820 qRT-PCR
T4 DNA Ligase NEB M0202 Ligation
TRIzol  Invitrogen 15596018 RNA isolation
Tryptone Oxoid LP0042 for broth preparation
Yeast extract Oxoid LP0021 for broth preparation
centrifuge Eppendorf 5418 centrifugation
Electrophoresis apparatus Bio-Rad 164-5050 Electrophoresis
 Electroporation System Bio-Rad 165-2100 for bacterial transformation
Spectrophotometer BioTek Epoch Absorbance detection
Real-Time PCR system Applied Biosystems 7500 system qRT-PCR

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Citer Cet Article
Meng, X., Cui, W., Meng, X., Wang, J., Wang, J., Zhu, G. A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis. J. Vis. Exp. (167), e61808, doi:10.3791/61808 (2021).

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