الكشف عن تعبير MicroRNA في كليتي الغلوبولين المناعي A الفئران الكلوية
Summary
وتشارك microRNAs في التسبب في اعتلال الكلية IgA. لقد طورنا طريقة موثوقة للكشف عن مستويات تعبير microRNA في كليتي نموذج فأر اعتلال الكلية IgA (فئران HIGA). ستسهل هذه الطريقة الجديدة التحقق من تورط miRNAs في اعتلال الكلية IgA.
Abstract
اعتلال الكلية بالغلوبولين المناعي A (IgA) هو نوع من التهاب كبيبات الكلى الأولي الذي يتميز بالترسب غير الطبيعي ل IgA ، مما يؤدي إلى الفشل الكلوي في المرحلة النهائية. في السنوات الأخيرة ، تم الإبلاغ عن تورط microRNAs (miRNAs) في التسبب في اعتلال الكلية IgA. ومع ذلك ، لا توجد طريقة ثابتة لتحديد سمات miRNAs في اعتلال الكلية IgA باستخدام نماذج حيوانية صغيرة. لذلك ، قمنا بتطوير طريقة موثوقة لتحليل miRNA في كلية نموذج الماوس IgA (ماوس HIGA). الهدف من هذا البروتوكول هو الكشف عن مستويات التعبير المتغيرة لل miRNAs في كليتي الفئران HIGA عند مقارنتها بالمستويات الموجودة في الكلى للفئران الضابطة. باختصار ، تتكون هذه الطريقة من أربع خطوات: 1) الحصول على عينات الكلى من الفئران HIGA. 2) تنقية الحمض النووي الريبي الكلي من عينات الكلى. 3) توليف الحمض النووي التكميلي من إجمالي الحمض النووي الريبي ؛ و 4) تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي الكمي (qRT-PCR) ل miRNAs. باستخدام هذه الطريقة ، اكتشفنا بنجاح مستويات التعبير للعديد من miRNAs (miR-155-5p و miR-146a-5p و miR-21-5p) في كليتي فئران HIGA. يمكن تطبيق هذه الطريقة الجديدة على دراسات أخرى تنميط miRNAs في اعتلال الكلية IgA.
Introduction
اعتلال الكلية المناعي A (IgA) هو نوع من التهاب كبيبات الكلى الأولي الذي يتميز بالترسب غير الطبيعي ل IgA في المنطقة المتوسطة الكبيبية الكلوية 1,2. هذا هو الأكثر شيوعا من التهاب كبيبات الكلى الأولي ويؤدي إلى الفشل الكلوي في المرحلة النهائية في 20 ٪ -40 ٪ من المرضى2. لا يزال السبب غير معروف ولكن العدوى المخاطية المستمرة متورطة 1,3. تم اقتراح الستيرويدات القشرية ومثبطات المناعة ومثبطات نظام الرينين أنجيوتنسين كطرق علاجية1،3 ، ولكن لم يتم تأسيسها بالكامل 3. لذلك ، هناك حاجة إلى مزيد من البحث لتوضيح المسببات والطرق العلاجية لعلاج اعتلال الكلية IgA.
microRNAs (miRNAs) هي RNAs صغيرة غير مشفرة تلعب دورا مهما في تنظيم التعبير الجيني 4,5. تم الإبلاغ عن أن miRNAs متورطة في التسبب في أمراض مختلفة ، وقد تم تحديد بعضها كمؤشرات حيوية للمرض وعوامل علاجية 4,5. في السنوات الأخيرة ، تم الإبلاغ أيضا عن ارتباط بين miRNAs والتسبب في اعتلال الكلية IgA2،6،7. على سبيل المثال ، تبين أن miR-148b متورط في التشوهات الهيكلية ل IgA في المرضى الذين يعانون من اعتلال الكلية IgA2،6،7 ، بينما تم توثيق miR-148b و let-7b كمؤشرات حيوية جديدة للكشف عن اعتلال الكلية IgA 7. على الرغم من أن فهم آثار miRNAs على اعتلال الكلية IgA قد يساعد في توضيح المسببات والعلاج 2 ، إلا أن الطرق القياسية لتحديد سمات miRNAs في اعتلال الكلية IgA باستخدام نماذج حيوانية صغيرة لم يتم تحديدها بعد2.
لقد طورنا هنا طريقة بسيطة وموثوقة لقياس مستويات تعبير miRNA في كليتي نموذج فأر اعتلال الكلية IgA (فئران HIGA). فأر HIGA هو سلالة DDY مميزة تظهر مستوى مرتفعا بشكل خاص من مصل IgA وترسب غير طبيعي ل IgA في كبيبات الكلى8،9،10،11. لذلك ، يمكن استخدام الفئران HIGA كنموذج فأر اعتلال الكلية IgA8،9،10،11. تتكون طريقتنا من أربع خطوات رئيسية: أولا ، الحصول جراحيا على عينات الكلى من فئران HIGA. ثانيا ، تجانس العينات وتنقية الحمض النووي الريبي الكلي باستخدام عمود الدوران القائم على غشاء السيليكا ؛ ثالثا ، توليف الحمض النووي المكمل (cDNA) من إجمالي الحمض النووي الريبي باستخدام النسخ العكسي ؛ ورابعا ، الكشف عن مستويات التعبير عن miRNA بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي الكمي (qRT-PCR). ويستند الأساس المنطقي لهذه الطريقة وموثوقية النتائج إلى التقارير السابقة12,13. لقد أظهرنا أن هذه تقنية مفيدة لقياس مستويات تعبير miRNA بدقة في نموذج فأر اعتلال الكلية IgA ، وأنه يمكن استخدامه لتسهيل البحث المستقبلي في miRNAs في اعتلال الكلية IgA.
Protocol
Representative Results
Discussion
تمكنا من قياس مستويات التعبير عن miRNAs في كليتي فأر اعتلال الكلية IgA (فئران HIGA) باستخدام هذه الطريقة الجديدة. اعتلال الكلية IgA هو مرض غير مبرر يحتاج إلى مزيد من البحث لتوضيح مسبباته وأهدافه العلاجية 1,3. ومع ذلك ، فإن الحصول على عينات الكلى البشرية أمر شديد التوغ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر سارة ويليامز ، دكتوراه ، من مجموعة Edanz (www.edanzediting.com) لتحرير مسودة هذه المخطوطة.
Materials
| BALB/cCrSlc (25-week-old, female) | Japan SLC, Inc. | none | Mouse for control |
| HIGA/NscSlc (25-week-old, female) | Japan SLC, Inc. | none | IgA nephropathy mouse model |
| MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | adhesive film for 96-well reaction plate |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | Experimental kit for synthesis of cDNA |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Experimental kit fot extraction of total RNA |
| miScript Primer Assay (RNU6-2) | Qiagen | MS00033740 | miRNA-specific primer |
| miScript Primer Assay (miR-155-5p) | Qiagen | MS00001701 | miRNA-specific primer |
| miScript Primer Assay (miR-146a-5p) | Qiagen | MS00001638 | miRNA-specific primer |
| miScript Primer Assay (miR-21-5p) | Qiagen | MS00009079 | miRNA-specific primer |
| miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | Experimental kit for real-time PCR |
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | biopolymer-shredding spin column |
| QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument |
| QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument software |
| takara biomasher standard | Takara Bio | 9790B | silicon homogenizer |
References
- Rodrigues, J. C., Haas, M., Reich, H. N. IgA Nephropathy. Clinical Journal of the American Society of Nephrology. 12 (4), 677-686 (2017).
- Szeto, C. C., Li, P. K. MicroRNAs in IgA nephropathy. Nature Reviews Nephrology. 10 (5), 249-256 (2014).
- Wyatt, R. J., Julian, B. A. IgA nephropathy. The New England Journal of Medicine. 368 (25), 2402-2414 (2013).
- Vishnoi, A., Rani, S. MiRNA Biogenesis and Regulation of Diseases: An Overview. Methods in Molecular Biology. 1509, 1-10 (2017).
- Rupaimoole, R., Slack, F. J. MicroRNA therapeutics: towards a new era for the management of cancer and other diseases. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (3), 203-222 (2017).
- Serino, G., Sallustio, F., Cox, S. N., Pesce, F., Schena, F. P. Abnormal miR-148b expression promotes aberrant glycosylation of IgA1 in IgA nephropathy. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (5), 814-824 (2012).
- Serino, G., et al. In a retrospective international study, circulating miR-148b and let-7b were found to be serum markers for detecting primary IgA nephropathy. Kidney International. 89 (3), 683-692 (2016).
- Muso, E., et al. Enhanced production of glomerular extracellular matrix in a new mouse strain of high serum IgA ddY mice. Kidney International. 50 (6), 1946-1957 (1996).
- Kurano, M., Yatomi, Y. Use of gas chromatography mass spectrometry to elucidate metabolites predicting the phenotypes of IgA nephropathy in hyper IgA mice. Plos One. 14 (7), 0219403 (2019).
- Hyun, Y. Y., et al. Adipose-derived stem cells improve renal function in a mouse model of IgA nephropathy. Cell Transplantation. 21 (11), 2425-2439 (2012).
- Katsuma, S., et al. Genomic analysis of a mouse model of immunoglobulin A nephropathy reveals an enhanced PDGF-EDG5 cascade. The Pharmacogenomics Journal. 1 (3), 211-217 (2001).
- Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit. BioTechniques. 40 (1), 54-58 (2006).
- Mestdagh, P., et al. Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study. Nature Methods. 11 (8), 809-815 (2014).
- Sauer, E., Babion, I., Madea, B., Courts, C. An evidence based strategy for normalization of quantitative PCR data from miRNA expression analysis in forensic organ tissue identification. Forensic Science International: Genetics. 13, 217-223 (2014).
- Wang, G., et al. Elevated levels of miR-146a and miR-155 in kidney biopsy and urine from patients with IgA nephropathy. Disease Markers. 30 (4), 171-179 (2011).
- Hennino, M. F., et al. miR-21-5p renal expression is associated with fibrosis and renal survival in patients with IgA nephropathy. Scientific Reports. 6, 27209 (2016).
- Green, M. R., Sambrook, J. . How to Win the Battle with RNase. 2019 (2), (2019).
