Un modelo de xenoinjerto derivado del paciente para la malformación venosa
Summary
Presentamos un protocolo detallado para generar un modelo de xenoinjerto murino de malformación venosa. Este modelo se basa en la inyección subcutánea de células endoteliales derivadas del paciente que contienen mutaciones hiperactivantes de los genes TIE2 y/o PIK3CA. Las lesiones de xenoinjerto recapitulan estrechamente las características histopatológicas del tejido del paciente con VM.
Abstract
La malformación venosa (VM) es una anomalía vascular que surge del deterioro del desarrollo de la red venosa que resulta en venas dilatadas y a menudo disfuncionales. El propósito de este artículo es describir cuidadosamente el establecimiento de un modelo de xenoinjerto murino que imita la VM humana y es capaz de reflejar la heterogeneidad del paciente. Las mutaciones TEK (TEK2) y PIK3CA no heredadas hiperactivantes en células endoteliales (EC) se han identificado como los principales impulsores de la ampliación patológica del buque en la máquina virtual. El siguiente protocolo describe el aislamiento, purificación y expansión de la CE derivada del paciente que expresa EL TIE2 mutante y/o PIK3CA. Estas EC se inyectan por vía subcutánea en la parte posterior de ratones athímicos inmunodeficientes para generar canales vasculares ectáticos. Las lesiones generadas con TIE2 o PIK3CA-mutant EC se vascularizan visiblemente dentro de los 7 u20129 días de la inyección y recapitulan las características histopatológicas del tejido del paciente con VM. Este modelo de xenoinjerto de VM proporciona una plataforma confiable para investigar los mecanismos celulares y moleculares que impulsan la formación y expansión de máquinas virtuales. Además, este modelo será fundamental para los estudios traslacionales que prueban la eficacia de los nuevos candidatos a fármacos en la prevención de la ampliación anormal de los vasos observados en la máquina virtual humana.
Introduction
Los defectos en el desarrollo de la vasculatura son la causa subyacente de muchas enfermedades, incluida la malformación venosa (VM). La VM es una enfermedad congénita caracterizada por morfogénesis anormal y expansión de las venas1. Importantes estudios sobre el tejido VM y las células endoteliales (EC) han identificado mutaciones de ganancia de función en dos genes: TEK, que codifica el receptor de tirosina quinasa TIE2, y PIK3CA,que codifica la isoforma p110o (subunidad catalítica) de PI3-kinasa (PI3K)2,3,,4,5. Estas mutaciones somáticas dan lugar a la hiperactivación independiente del ligando de vías clave de señalización angiogénica/crecimiento, incluyendo PI3K/AKT, lo que resulta en venas ectáticas dilatadas3. A pesar de estos importantes descubrimientos genéticos, los mecanismos celulares y moleculares subsiguientes que desencadenan la angiogénesis anormal y la formación de canales vasculares agrandados todavía no se entienden completamente.
Durante la angiogénesis normal y patológica, los nuevos vasos brotan de una red vascular preexistente y la EC se someten a una secuencia de procesos celulares importantes, incluyendo la proliferación, la migración, la remodelación de la matriz extracelular (ECM) y la formación de lúmenes6. Los cultivos in vitro bidimensionales y tridimensionales (2D/3D) de EC son herramientas importantes para investigar cada una de estas propiedades celulares individualmente. Sin embargo, existe una clara demanda de un modelo de ratón que recapitula la ampliación de los vasos patológicos dentro del microambiente anfitrión, al tiempo que proporciona una plataforma eficaz para la evaluación preclínica de fármacos específicos para la investigación traslacional.
Hasta la fecha, no se ha notificado un modelo murino transgénico de VM asociado con mutaciones de ganancia de función de TIE2. Los modelos actuales de ratón VM transgénicos se basan en la expresión omnipresente o restringida en los tejidos de la mutación activadora PIK3CA p.H1047R3,5. Estos animales transgénicos proporcionan una visión significativa de los efectos específicos de todo el cuerpo o tejido de esta mutación PIK3CA de punto caliente. La limitación de estos modelos es la formación de una red vascular altamente patológica que resulta en la letalidad temprana. Por lo tanto, estos modelos de ratón no reflejan completamente la ocurrencia esporádica de eventos mutacionales y la naturaleza localizada de la patología de la VM.
Por el contrario, los modelos de xenoinjerto derivados del paciente se basan en el trasplante o la inyección de tejido patológico o células derivadas de pacientes en ratones inmunodeficientes7. Los modelos de xenoinjertos son una poderosa herramienta para ampliar el conocimiento sobre el desarrollo de enfermedades y el descubrimiento de nuevos agentes terapéuticos8. Además, el uso de células derivadas del paciente permite a los científicos recapitular la heterogeneidad de la mutación para estudiar el espectro de fenotipos de pacientes.
Aquí, describimos un protocolo en el que la EC VM derivada del paciente que expresa una forma mutante constitutivamente activa de TIE2 y/o PIK3CA se inyecta por vía subcutánea en la parte posterior de ratones desnudos athímicos. Las células vasculares inyectadas se suspenden en un marco ECM para promover la angiogénesis como se describe en los modelos anteriores de xenoinjerto vascular9,10,11. Estos VM EC sufren una morfogénesis significativa y generan vasos patológicos agrandados y perfundidos en ausencia de células de soporte. El modelo de xenoinjerto descrito de VM proporciona una plataforma eficiente para la evaluación preclínica de fármacos específicos por su capacidad para inhibir la expansión de lúmenes no controlada.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, describimos un método para generar un modelo de xenoinjerto derivado del paciente de VM. Este modelo murino presenta un excelente sistema que permite a los investigadores obtener una comprensión más profunda de la agrandación patológica del lumen y será fundamental en el desarrollo de terapias más eficaces y dirigidas para el tratamiento de la VM. Esto se puede adaptar fácilmente para investigar otros tipos de anomalías vasculares como la malformación venosa linfática capilar16. …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores quieren agradecer a Nora Lakes por su corrección. La investigación reportada en este manuscrito fue apoyada por el Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre, bajo el Premio R01 HL117952 (E.B.), parte de los Institutos Nacionales de Salud. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.
Materials
| Athymic nude mice, (Foxn1-nu); 5-6 weeks, males | Envigo | 069(nu)/070(nu/+) | Subcutaneous injection |
| Biotinylated Ulex europeaus Agglutinin-I (UEA-I) | Vector Laboratories | B-1065 | Histological anlaysis |
| Bottle top filter (500 ml; 0.2 µM) | Thermo Fisher | 974106 | Cell culture |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | BSA | A7906-50MG | Cell culture; Histological analysis |
| Calcium cloride dihydrate (CaCl2.2H2O) | Sigma | C7902-500G | Cell culture |
| Caliper | Electron Microscopy Sciences | 50996491 | Lesion plug measurment |
| CD31-conjugated magnetic beads (Dynabeads) | Life Technologies | 11155D | EC separation |
| Cell strainer (100 μM) | Greiner | 542000 | Cell culture |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | Cell culture |
| Conical Tube; polypropylene (15 mL) | Greiner | 07 000 241 | Cell culture |
| Conical Tube; polypropylene (50 mL) | Greiner | 07 000 239 | Cell culture |
| Coplin staining jar | Ted Pella | 21029 | Histological anlaysis |
| Coverglass (50 X 22 mm) | Fisher Scientific | 12545E | Histological anlaysis |
| DAB: 3,3'Diaminobenzidine Reagent (ImmPACT DAB) | Vector Laboratories | SK-4105 | Histological anlaysis |
| Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM) | Corning | 10-027-CV | Cell culture |
| DynaMag-2 | Life Technologies | 12321D | EC separation |
| Ear punch | VWR | 10806-286 | Subcutaneous injection |
| EDTA (0.5M, pH 8.0) | Life Technologies | 15575-020 | Histological anlaysis |
| Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM2) Bulletkit (basal medium and supplements) | Lonza | CC-3162 | Cell culture |
| Eosin Y (alcohol-based) | Thermo Scientific | 71211 | Histological anlaysis |
| Ethanol | Decon Labs | 2716 | Histological anlaysis |
| Fetal Bovine Serum (FBS) , HyClone | GE Healthcare | SH30910.03 | Cell culture |
| Filter tip 1,250 μL | MidSci | AV1250-H | Multiple steps |
| Filter tip 20 μL | VWR | 10017-064 | Multiple steps |
| Filter tip 200 μL | VWR | 10017-068 | Multiple steps |
| Formalin buffered solution (10%) | Sigma | F04586 | Lesion plug dissection |
| Hemacytometer (INCYTO; Disposable) | SKC FILMS | DHCN015 | Cell culture |
| Hematoxylin | Vector Hematoxylin | H-3401 | Histological anlaysis |
| Human plasma fibronectin purified protein (1mg/mL) | Sigma | FC010-10MG | Cell culture |
| Hydrogen Peroxide solution (30% w/w) | Sigma | H1009 | Histological anlaysis |
| ImageJ Software | Analysis | ||
| Isoflurane, USP | Akorn Animal Health | 59399-106-01 | Subcutaneous injection |
| magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Sigma | M1880-500G | Cell culture |
| Basement Membrane Matrix (Phenol Red-Free; LDEV-free) | Corning | 356237 | Subcutaneous injection |
| Microcentrifuge tube (1.5 mL) | VWR | 87003-294 | EC separation |
| Microscope Slide Superfrost (75mm X 25mm) | Fisher Scientific | 1255015-CS | Histological anlaysis |
| Needles, 26G x 5/8 inch Sub-Q sterile needles | Becton Dickinson (BD) | BD305115 | Subcutaneous injection |
| Normal horse serum | Vector Laboratories | S-2000 | Histological anlaysis |
| Penicillin-Streptomycin-L-Glutamine (100X) | Corning | 30-009-CI | Cell culture |
| Permanent mounting medium (VectaMount) | Vector Laboratories | H-5000 | Histological anlaysis |
| Pestle Size C, Plain | Thomas Scientific | 3431F55 | EC isolation |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3994 | Cell culture |
| Scale | VWR | 65500-202 | Subcutaneous injection |
| Serological pipettes (10 ml) | VWR | 89130-898 | Cell culture |
| Serological pipettes (5ml) | VWR | 89130-896 | Cell culture |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Sigma | 223530 | Cell culture |
| Streptavidin, Horseradish Peroxidase, Concentrate, for IHC | Vector Laboratories | SA-5004 | Cell culture |
| Syringe (60ml) | BD Biosciences | 309653 | Cel culture |
| SYRINGE FILTER (0.2 µM) | Corning | 431219 | Cell culture |
| Syringes (1 mL with Luer Lock) | Becton Dickinson (BD) | BD-309628 | Subcutaneous injection |
| Tissue culture-treated plate (100 X 20 mm) | Greiner | 664160 | Cell culture |
| Tissue culture-treated plate (145X20 mm) | Greiner | 639160 | Cell culture |
| Tissue culture-treated plates (60 X 15) mm | Eppendorf | 30701119 | Cell culture |
| Tris-base (Trizma base) | Sigma | T6066 | Histological anlaysis |
| Trypan Blue Solution (0.4 %) | Life Technologies | 15250061 | Cell culture |
| Trypsin EDTA, 1X (0.05% Trypsin/0.53mM EDTA) | Corning | 25-052-Cl | Cell culture |
| Tween-20 | Biorad | 170-6531 | Histological anlaysis |
| Wheaton bottle | VWR | 16159-798 | Cell culture |
| Xylenes | Fisher Scientific | X3P-1GAL | Histological anlaysis |
References
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