静脉畸形的患者衍生异种移植模型
Summary
我们提出了一个详细的协议，以生成静脉畸形的杂音异种模型。该模型基于患者衍生的内皮细胞的皮下注射，这些内皮细胞含有超激活的 TIE2 和/或 PIK3CA 基因突变。异种移植病变密切回顾VM患者组织组织组织病理学特征。
Abstract
静脉畸形 （VM） 是一种血管异常，由静脉网络发育受损而引起，导致静脉扩张且经常功能失调。本文的目的是仔细描述一个模拟人类VM并且能够反映患者异质性的Murine异种移植模型的建立。在内皮细胞（EC）中超活化非遗传（体细胞 ）TEK（TIE2） 和 PIK3CA 突变被确定为VM中病理血管增大的主要驱动因素。以下协议描述了患者衍生的EC表达突变 TIE2 和/或 PIK3CA 的隔离、纯化和扩展。这些EC被注射到免疫缺陷的脑膜小鼠的背部，以产生分血管通道。TIE2 或 PIK3CA 突变 EC 产生的病变在注射后 7~u20129 天内明显血管化，并重述 VM 患者组织组织组织组织病理学特征。此 VM 异种移植模型为研究驱动 VM 形成和扩展的细胞和分子机制提供了一个可靠的平台。此外，该模型将有助于转化研究，测试新药候选药物在防止人类VM中异常血管增大的疗效。
Introduction
血管发育中的缺陷是许多疾病的根本原因，包括静脉畸形（VM）。VM是一种先天性疾病，其特征是血管异常形态和扩张。关于VM组织和内皮细胞（EC）的重要研究已经确定了两个基因的功能增益突变：TEK，编码酪氨酸激酶受体TYE2，和PIK3CA，编码PI3-激酶（PI3K）的p110+（催化亚基）等构形式2,32，3，4，5。,4,5这些体细胞突变导致关键血管生成/生长信号通路（包括PI3K/AKT）的配体独立超活化，从而导致扩张的肠黄静脉3。尽管这些重要的基因发现，随后的细胞和分子机制触发异常血管生成和扩大血管通道的形成仍然没有完全了解。
在正常和病理血管生成期间，新血管从预先存在的血管网络发芽，EC经历一系列重要的细胞过程，包括增殖、迁移、细胞外基质（ECM）重塑和流明形成6。EC 的二维和三维 （2D/3D） 体外培养物是单独研究每个细胞特性的重要工具。然而，显然需要用鼠标模型在宿主微环境内重述病理血管的扩大，同时为转化研究的目标药物提供有效的临床前评估平台。
到目前为止，尚未报告与 TIE2 功能增益突变相关的 VM 转基因喃生基因模型。目前的转基因VM小鼠模型依赖于激活突变PIK3CA p.H1047R3，5的无所不在或组织受限的表达。这些转基因动物提供了对这个热点PIK3CA突变的全身或组织特异性效应的显著洞察。这些模型的局限性是形成高度病理的血管网络，导致早期杀伤力。因此，这些小鼠模型不能充分反映突变事件的零星发生和VM病理学的局部性质。
相反，患者衍生的异种移植模型是基于移植或注射病理组织或细胞从患者衍生到免疫缺陷小鼠7。Xenograft模型是一个强大的工具，以扩大有关疾病开发和发现新的治疗剂8的知识。此外，使用患者衍生细胞允许科学家重新综述突变异质性，以研究患者表型的光谱。
在这里，我们描述了一个协议，其中患者衍生的VM EC，表示一个突变的组成活性形式的 TIE2 和/或PIK3CA被注射皮下在脂肪裸鼠的背部。注射的血管细胞悬浮在ECM框架中，以促进血管生成，如以前的血管异种移植模型9，10，1110,所述。9这些VM EC经历显著形态生成，在没有支撑细胞的情况下产生扩大的、充满的病理血管。VM 的异种移植模型为靶向药物的临床前评估提供了一个有效的平台，用于抑制不受控制的流明扩张的能力。
Protocol
患者组织样本是在辛辛那提儿童医院医疗中心（CCHMC）、癌症和血液疾病研究所根据机构政策经批准的机构审查委员会（IRB）获得组织样本和肿瘤和血管异常患者组织样本和数据收集和储存的知情同意后，经临床调查委员会批准的。以下所述的所有动物程序都经过 CCHMC 机构动物护理和使用委员会的审查和批准。 1. 材料和库存解决方案的准备 完整内皮细胞生长介质的准…
Representative Results
该协议描述了基于皮肤注射患者衍生的EC到免疫缺陷裸鼠背部的VM的murine异种移植模型的过程。内皮细胞菌落可以在从VM组织或病变血中分离后4周内收获（图1A，B）。注射后的第二天，异种移植病变塞覆盖面积约80\u2012100 mm2。在我们的手中，带 TIE2/PIK3CA 突变EC的病变塞在注射14、15（图1C-E）后7~u20129天内明显15血…
Discussion
在这里，我们描述了一种生成患者派生的 VM 异种移植模型的方法。这个 Murine 模型提供了一个优秀的系统，使研究人员能够更深入地了解病理流明的增大，并将有助于开发更有效和有针对性的治疗 VM。这可以很容易地适应调查其他类型的血管异常，如毛细血管淋巴静脉畸形16。有几个步骤对于成功生成可重复的血管病变至关重要。首先，患者衍生的内皮细胞必须是纯的（没有其?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者要感谢诺拉湖校对。本手稿中报告的研究得到了国家心脏、肺和血液研究所的支持，该学会获得国家健康研究院的一部分，其奖项编号为 R01 HL117952（E.B.）。内容完全由作者负责，不一定代表国家卫生研究院的官方观点。
Materials
| Athymic nude mice, (Foxn1-nu); 5-6 weeks, males | Envigo | 069(nu)/070(nu/+) | Subcutaneous injection |
| Biotinylated Ulex europeaus Agglutinin-I (UEA-I) | Vector Laboratories | B-1065 | Histological anlaysis |
| Bottle top filter (500 ml; 0.2 µM) | Thermo Fisher | 974106 | Cell culture |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | BSA | A7906-50MG | Cell culture; Histological analysis |
| Calcium cloride dihydrate (CaCl2.2H2O) | Sigma | C7902-500G | Cell culture |
| Caliper | Electron Microscopy Sciences | 50996491 | Lesion plug measurment |
| CD31-conjugated magnetic beads (Dynabeads) | Life Technologies | 11155D | EC separation |
| Cell strainer (100 μM) | Greiner | 542000 | Cell culture |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | Cell culture |
| Conical Tube; polypropylene (15 mL) | Greiner | 07 000 241 | Cell culture |
| Conical Tube; polypropylene (50 mL) | Greiner | 07 000 239 | Cell culture |
| Coplin staining jar | Ted Pella | 21029 | Histological anlaysis |
| Coverglass (50 X 22 mm) | Fisher Scientific | 12545E | Histological anlaysis |
| DAB: 3,3'Diaminobenzidine Reagent (ImmPACT DAB) | Vector Laboratories | SK-4105 | Histological anlaysis |
| Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM) | Corning | 10-027-CV | Cell culture |
| DynaMag-2 | Life Technologies | 12321D | EC separation |
| Ear punch | VWR | 10806-286 | Subcutaneous injection |
| EDTA (0.5M, pH 8.0) | Life Technologies | 15575-020 | Histological anlaysis |
| Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM2) Bulletkit (basal medium and supplements) | Lonza | CC-3162 | Cell culture |
| Eosin Y (alcohol-based) | Thermo Scientific | 71211 | Histological anlaysis |
| Ethanol | Decon Labs | 2716 | Histological anlaysis |
| Fetal Bovine Serum (FBS) , HyClone | GE Healthcare | SH30910.03 | Cell culture |
| Filter tip 1,250 μL | MidSci | AV1250-H | Multiple steps |
| Filter tip 20 μL | VWR | 10017-064 | Multiple steps |
| Filter tip 200 μL | VWR | 10017-068 | Multiple steps |
| Formalin buffered solution (10%) | Sigma | F04586 | Lesion plug dissection |
| Hemacytometer (INCYTO; Disposable) | SKC FILMS | DHCN015 | Cell culture |
| Hematoxylin | Vector Hematoxylin | H-3401 | Histological anlaysis |
| Human plasma fibronectin purified protein (1mg/mL) | Sigma | FC010-10MG | Cell culture |
| Hydrogen Peroxide solution (30% w/w) | Sigma | H1009 | Histological anlaysis |
| ImageJ Software | Analysis | ||
| Isoflurane, USP | Akorn Animal Health | 59399-106-01 | Subcutaneous injection |
| magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Sigma | M1880-500G | Cell culture |
| Basement Membrane Matrix (Phenol Red-Free; LDEV-free) | Corning | 356237 | Subcutaneous injection |
| Microcentrifuge tube (1.5 mL) | VWR | 87003-294 | EC separation |
| Microscope Slide Superfrost (75mm X 25mm) | Fisher Scientific | 1255015-CS | Histological anlaysis |
| Needles, 26G x 5/8 inch Sub-Q sterile needles | Becton Dickinson (BD) | BD305115 | Subcutaneous injection |
| Normal horse serum | Vector Laboratories | S-2000 | Histological anlaysis |
| Penicillin-Streptomycin-L-Glutamine (100X) | Corning | 30-009-CI | Cell culture |
| Permanent mounting medium (VectaMount) | Vector Laboratories | H-5000 | Histological anlaysis |
| Pestle Size C, Plain | Thomas Scientific | 3431F55 | EC isolation |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3994 | Cell culture |
| Scale | VWR | 65500-202 | Subcutaneous injection |
| Serological pipettes (10 ml) | VWR | 89130-898 | Cell culture |
| Serological pipettes (5ml) | VWR | 89130-896 | Cell culture |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Sigma | 223530 | Cell culture |
| Streptavidin, Horseradish Peroxidase, Concentrate, for IHC | Vector Laboratories | SA-5004 | Cell culture |
| Syringe (60ml) | BD Biosciences | 309653 | Cel culture |
| SYRINGE FILTER (0.2 µM) | Corning | 431219 | Cell culture |
| Syringes (1 mL with Luer Lock) | Becton Dickinson (BD) | BD-309628 | Subcutaneous injection |
| Tissue culture-treated plate (100 X 20 mm) | Greiner | 664160 | Cell culture |
| Tissue culture-treated plate (145X20 mm) | Greiner | 639160 | Cell culture |
| Tissue culture-treated plates (60 X 15) mm | Eppendorf | 30701119 | Cell culture |
| Tris-base (Trizma base) | Sigma | T6066 | Histological anlaysis |
| Trypan Blue Solution (0.4 %) | Life Technologies | 15250061 | Cell culture |
| Trypsin EDTA, 1X (0.05% Trypsin/0.53mM EDTA) | Corning | 25-052-Cl | Cell culture |
| Tween-20 | Biorad | 170-6531 | Histological anlaysis |
| Wheaton bottle | VWR | 16159-798 | Cell culture |
| Xylenes | Fisher Scientific | X3P-1GAL | Histological anlaysis |
References
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Citer Cet Article
Schrenk, S., Goines, J., Boscolo, E. A Patient-Derived Xenograft Model for Venous Malformation. J. Vis. Exp. (160), e61501, doi:10.3791/61501 (2020).