Venöz Malformasyon için Hasta Kaynaklı Ksenogreft Modeli
Summary
Venöz malformasyonun murine ksenogreft modelini oluşturmak için ayrıntılı bir protokol sayılmiyoruz. Bu model, hiper aktive edici TIE2 ve/veya PIK3CA gen mutasyonları içeren hasta kaynaklı endotel hücrelerinin deri altı enjeksiyonuna dayanmaktadır. Ksenogreft lezyonları VM hasta dokusunun histopatolojik özelliklerini yakından özetler.
Abstract
Venöz malformasyon (VM), venöz ağın bozulmuş gelişiminden kaynaklanan ve sıklıkla işlevsiz venlerle sonuçlanan vasküler bir anomalidir. Bu makalenin amacı, insan VM’sini taklit eden ve hasta heterojenliğini yansıtabilen bir murine ksenogreft modelinin kurulmasını dikkatle tanımlamaktır. VM’de patolojik damar genişlemesinin başlıca itici etkenleri olarak endotel hücrelerinde (EC) hiper-aktive edici olmayan (somatik) TEK (TIE2) ve PIK3CA mutasyonları tespit edilmiştir. Aşağıdaki protokol, mutant TIE2 ve/veya PIK3CA’yı ifade eden hasta kaynaklı EC’nin izolasyonu, saflaştırılması ve genişlemesini açıklamaktadır. Bu EC ektatik vasküler kanallar oluşturmak için immünoeksik atimik farelerin arkasına subkutan enjekte edilir. TIE2 veya PIK3CA-mutant EC ile oluşturulan lezyonlar enjeksiyondan sonraki 7\u20129 gün içinde gözle görülür şekilde vaskülarize edilir ve VM hasta dokusunun histopatolojik özelliklerini yeniden özetler. Bu VM ksenogreft modeli VM oluşumu ve genişlemesi sürüş hücresel ve moleküler mekanizmaları araştırmak için güvenilir bir platform sağlar. Buna ek olarak, bu model insan VM görülen anormal damar genişlemesini önlemede yeni ilaç adaylarının etkinliğini test çeviri çalışmaları için etkili olacaktır.
Introduction
Vaskülatür gelişimindeki bozukluklar venöz malformasyon (VM) gibi birçok hastalığın altında yatan nedenlerdir. VM anormal morfogenez ve damar genişlemesi ile karakterize konjenital bir hastalıktır1. VM doku ve endotel hücreleri (EC) üzerinde yapılan önemli çalışmalar iki gende fonksiyon kazanım mutasyonları tespit etti: TEK, tirozin kinaz reseptörü TIE2 kodlayan, ve PIK3CA, p110α kodlayan (katalitik alt birim) PI3-kinaz (PI3K)2,,3,4,5. Bu somatik mutasyonlar, PI3K/AKT dahil olmak üzere anahtar anjiyojenik/büyüme sinyal yollarının ligand-bağımsız hiper aktivasyonuile sonuçlanır ve böylece dilate ektatik venler3ile sonuçlanır. Bu önemli genetik keşiflere rağmen, anormal anjiyogenezi tetikleyen sonraki hücresel ve moleküler mekanizmalar ve genişlemiş vasküler kanalların oluşumu hala tam olarak anlaşılamamıştır.
Normal ve patolojik anjiyogenez sırasında, yeni damarlar önceden varolan vasküler ağdan filizlenir ve EC proliferasyon, göç, hücre dışı matriks (ECM) remodeling ve lümen oluşumu 6 dahil olmak üzere önemli hücresel süreçlerin bir dizi geçmesi6. EC’nin iki ve üç boyutlu (2D/3D) in vitro kültürleri bu hücresel özelliklerin her birini ayrı ayrı araştırmak için önemli araçlardır. Bununla birlikte, bir fare modeli ev sahibi mikro ortamda patolojik damar genişlemere açık bir talep ve çeviri araştırma için hedefli ilaçların preklinik değerlendirme için etkili bir platform sağlarken.
Bugüne kadar TIE2 fonksiyon artışı mutasyonları ile ilişkili vm transgenik bir murine modeli bildirilmemiştir. Mevcut transgenik VM fare modelleri, aktive mutasyonpik3CA p.H1047R3,5’inher yerde veya doku kısıtlamalı ekspresyonuna dayanır. Bu transgenik hayvanlar, bu sıcak nokta PIK3CA mutasyonunun tüm vücut veya dokuya özgü etkileri hakkında önemli bilgiler sağlar. Bu modellerin sınırlandırılması erken öldürücülük ile sonuçlanan yüksek patolojik vasküler ağ oluşumudur. Bu nedenle, bu fare modelleri mutasyonel olayların düzensiz oluşumunu ve VM patolojisinin lokalize doğasını tam olarak yansıtmamaktadır.
Aksine, hasta kaynaklı ksenogreft modelleri transplantasyon veya patolojik doku veya immünoeksik fareler içine hastalardan elde edilen hücrelerin enjeksiyon dayanmaktadır7. Ksenogreft modelleri hastalık gelişimi ve yeni terapötik ajanların keşfi hakkında bilgi genişletmek için güçlü bir araçtır8. Buna ek olarak, hasta kaynaklı hücreleri kullanarak bilim adamları hasta fenotipspektrum çalışması için mutasyon heterojenite recapitulate sağlar.
Burada, TIE2 ve/veya PIK3CA’nın mutant-aktif formunu ifade eden hasta kaynaklı VM EC’nin atimik çıplak farelerin arkasına deri altı enjekte edildiği bir protokolü açıklıyoruz. Enjekte edilen vasküler hücreler önceki vasküler ksenogreft modellerinde açıklandığı gibi anjiyogenezi teşvik etmek amacıyla Bir ECM çerçevesinde askıya alınır9,10,11. Bu VM EC önemli morfogenez geçmesi ve destekleyici hücrelerin yokluğunda genişlemiş, perfüzyon patolojik damarlar oluşturmak. VM’nin açıklanan ksenogreft modeli, kontrolsüz lümen genişlemesini inhibe edebilmeleri için hedeflenen ilaçların klinik öncesi değerlendirilmesi için etkili bir platform sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, VM’nin hasta kaynaklı ksenogreft modelini oluşturmak için bir yöntem açıklıyoruz. Bu rüre modeli araştırmacılar patolojik lümen genişleme daha derin bir anlayış kazanmak için izin veren mükemmel bir sistem sunuyor ve VM tedavisi için daha etkili ve hedefli tedaviler geliştirilmesinde etkili olacaktır. Bu kolayca kapiller lenfatik venöz malformasyon16gibi vasküler anomalilerin diğer türleri araştırmak için adapte edilebilir. Tekrarlanabilir vasküler lezyonların …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar prova için Nora Lakes teşekkür etmek istiyorum. Bu el yazmasında bildirilen araştırma Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü tarafından, Ödül Numarası R01 HL117952 (E.B.), Ulusal Sağlık Enstitüleri bir parçası altında desteklenmiştir. İçerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri’nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.
Materials
| Athymic nude mice, (Foxn1-nu); 5-6 weeks, males | Envigo | 069(nu)/070(nu/+) | Subcutaneous injection |
| Biotinylated Ulex europeaus Agglutinin-I (UEA-I) | Vector Laboratories | B-1065 | Histological anlaysis |
| Bottle top filter (500 ml; 0.2 µM) | Thermo Fisher | 974106 | Cell culture |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | BSA | A7906-50MG | Cell culture; Histological analysis |
| Calcium cloride dihydrate (CaCl2.2H2O) | Sigma | C7902-500G | Cell culture |
| Caliper | Electron Microscopy Sciences | 50996491 | Lesion plug measurment |
| CD31-conjugated magnetic beads (Dynabeads) | Life Technologies | 11155D | EC separation |
| Cell strainer (100 μM) | Greiner | 542000 | Cell culture |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | Cell culture |
| Conical Tube; polypropylene (15 mL) | Greiner | 07 000 241 | Cell culture |
| Conical Tube; polypropylene (50 mL) | Greiner | 07 000 239 | Cell culture |
| Coplin staining jar | Ted Pella | 21029 | Histological anlaysis |
| Coverglass (50 X 22 mm) | Fisher Scientific | 12545E | Histological anlaysis |
| DAB: 3,3'Diaminobenzidine Reagent (ImmPACT DAB) | Vector Laboratories | SK-4105 | Histological anlaysis |
| Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM) | Corning | 10-027-CV | Cell culture |
| DynaMag-2 | Life Technologies | 12321D | EC separation |
| Ear punch | VWR | 10806-286 | Subcutaneous injection |
| EDTA (0.5M, pH 8.0) | Life Technologies | 15575-020 | Histological anlaysis |
| Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM2) Bulletkit (basal medium and supplements) | Lonza | CC-3162 | Cell culture |
| Eosin Y (alcohol-based) | Thermo Scientific | 71211 | Histological anlaysis |
| Ethanol | Decon Labs | 2716 | Histological anlaysis |
| Fetal Bovine Serum (FBS) , HyClone | GE Healthcare | SH30910.03 | Cell culture |
| Filter tip 1,250 μL | MidSci | AV1250-H | Multiple steps |
| Filter tip 20 μL | VWR | 10017-064 | Multiple steps |
| Filter tip 200 μL | VWR | 10017-068 | Multiple steps |
| Formalin buffered solution (10%) | Sigma | F04586 | Lesion plug dissection |
| Hemacytometer (INCYTO; Disposable) | SKC FILMS | DHCN015 | Cell culture |
| Hematoxylin | Vector Hematoxylin | H-3401 | Histological anlaysis |
| Human plasma fibronectin purified protein (1mg/mL) | Sigma | FC010-10MG | Cell culture |
| Hydrogen Peroxide solution (30% w/w) | Sigma | H1009 | Histological anlaysis |
| ImageJ Software | Analysis | ||
| Isoflurane, USP | Akorn Animal Health | 59399-106-01 | Subcutaneous injection |
| magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Sigma | M1880-500G | Cell culture |
| Basement Membrane Matrix (Phenol Red-Free; LDEV-free) | Corning | 356237 | Subcutaneous injection |
| Microcentrifuge tube (1.5 mL) | VWR | 87003-294 | EC separation |
| Microscope Slide Superfrost (75mm X 25mm) | Fisher Scientific | 1255015-CS | Histological anlaysis |
| Needles, 26G x 5/8 inch Sub-Q sterile needles | Becton Dickinson (BD) | BD305115 | Subcutaneous injection |
| Normal horse serum | Vector Laboratories | S-2000 | Histological anlaysis |
| Penicillin-Streptomycin-L-Glutamine (100X) | Corning | 30-009-CI | Cell culture |
| Permanent mounting medium (VectaMount) | Vector Laboratories | H-5000 | Histological anlaysis |
| Pestle Size C, Plain | Thomas Scientific | 3431F55 | EC isolation |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3994 | Cell culture |
| Scale | VWR | 65500-202 | Subcutaneous injection |
| Serological pipettes (10 ml) | VWR | 89130-898 | Cell culture |
| Serological pipettes (5ml) | VWR | 89130-896 | Cell culture |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Sigma | 223530 | Cell culture |
| Streptavidin, Horseradish Peroxidase, Concentrate, for IHC | Vector Laboratories | SA-5004 | Cell culture |
| Syringe (60ml) | BD Biosciences | 309653 | Cel culture |
| SYRINGE FILTER (0.2 µM) | Corning | 431219 | Cell culture |
| Syringes (1 mL with Luer Lock) | Becton Dickinson (BD) | BD-309628 | Subcutaneous injection |
| Tissue culture-treated plate (100 X 20 mm) | Greiner | 664160 | Cell culture |
| Tissue culture-treated plate (145X20 mm) | Greiner | 639160 | Cell culture |
| Tissue culture-treated plates (60 X 15) mm | Eppendorf | 30701119 | Cell culture |
| Tris-base (Trizma base) | Sigma | T6066 | Histological anlaysis |
| Trypan Blue Solution (0.4 %) | Life Technologies | 15250061 | Cell culture |
| Trypsin EDTA, 1X (0.05% Trypsin/0.53mM EDTA) | Corning | 25-052-Cl | Cell culture |
| Tween-20 | Biorad | 170-6531 | Histological anlaysis |
| Wheaton bottle | VWR | 16159-798 | Cell culture |
| Xylenes | Fisher Scientific | X3P-1GAL | Histological anlaysis |
References
- Dompmartin, A., Vikkula, M., Boon, L. M. Venous malformation: update on aetiopathogenesis, diagnosis and management. Phlebology: The Journal of Venous Disease. 25 (5), 224-235 (2010).
- Limaye, N., et al. Somatic mutations in angiopoietin receptor gene TEK cause solitary and multiple sporadic venous malformations. Nature Genetics. 41 (1), 118-124 (2009).
- Castel, P., et al. Somatic PIK3CA mutations as a driver of sporadic venous malformations. Science Translational Medicine. 8 (332), 42 (2016).
- Limaye, N., et al. Somatic Activating PIK3CA Mutations Cause Venous Malformation. The American Journal of Human Genetics. 97 (6), 914-921 (2015).
- Castillo, S. D., et al. Somatic activating mutations in Pik3ca cause sporadic venous malformations in mice and humans. Science Translational Medicine. 8 (332), 43 (2016).
- Stratman, A. N., et al. Endothelial cell lumen and vascular guidance tunnel formation requires MT1-MMP-dependent proteolysis in 3-dimensional collagen matrices. Blood. 114 (2), 237-247 (2009).
- Okada, S., Vaeteewoottacharn, K., Kariya, R. Application of Highly Immunocompromised Mice for the Establishment of Patient-Derived Xenograft (PDX) Models. Cells. 8 (8), 889 (2019).
- Byrne, A. T., et al. Interrogating open issues in cancer precision medicine with patient-derived xenografts. Nature Reviews Cancer. 17 (4), 254-268 (2017).
- Allen, P., Melero-Martin, J., Bischoff, J. Type I collagen, fibrin and PuraMatrix matrices provide permissive environments for human endothelial and mesenchymal progenitor cells to form neovascular networks. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5 (4), 74 (2011).
- Allen, P., Kang, K. T., Bischoff, J. Rapid onset of perfused blood vessels after implantation of ECFCs and MPCs in collagen, PuraMatrix and fibrin provisional matrices. Journal of Tissue Engineering and Regenerative. 9 (5), 632-636 (2015).
- Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425 (2018).
- Roh, Y. N., et al. The results of surgical treatment for patients with venous malformations. Annals of Vascular Surgery. 26 (5), 665-673 (2012).
- Marler, J. J., Mulliken, J. B. Current management of hemangiomas and vascular malformations. Clinics in Plastic Surgery. 32 (1), 99-116 (2005).
- Goines, J., et al. A xenograft model for venous malformation. Angiogenesis. 21 (4), 725-735 (2018).
- Li, X., et al. Ponatinib Combined With Rapamycin Causes Regression of Murine Venous Malformation. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 39 (3), 496-512 (2019).
- Le Cras, T. D., et al. Constitutively active PIK3CA mutations are expressed by lymphatic and vascular endothelial cells in capillary lymphatic venous malformation. Angiogenesis. , 1-18 (2020).
- Boscolo, E., et al. Rapamycin improves TIE2-mutated venous malformation in murine model and human subjects. Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3491-3504 (2015).
