En patient-derived Xenograft modell för Venous Missformation
Summary
Vi presenterar ett detaljerat protokoll för att generera en murine xenograft modell av venous missbildning. Denna modell är baserad på subkutan injektion av patient-härledda endotelceller som innehåller hyper-aktiverande TIE2 och/eller PIK3CA genmutationer. Xenograft skador recapitulate nära de histopatologiska funktionerna i VM patient vävnad.
Abstract
Venous missbildning (VM) är en Vaskulär anomali som uppstår från nedsatt utveckling av det venous nätverket som resulterar i dilaterad och ofta dysfunktionella vener. Syftet med denna artikel är att noggrant beskriva inrättandet av en murine xenograft modell som härmar mänskliga VM och är kunna återspegla patientens heterogenitet. Hyper-aktiverande icke-ärvda (somatiska) TEK (TIE2) och PIK3CA mutationer i endotelceller (EG) har identifierats som de viktigaste drivkrafterna för patologiska fartyg utvidgningen i VM. Följande protokoll beskriver isolering, rening och utvidgning av patient-härledda EG uttrycker mutant TIE2 och/eller PIK3CA. Dessa EG injiceras subkutant i baksidan av immunodeficient athymic möss att generera ectatic Vaskulära kanaler. Skador som genereras med TIE2 eller PIK3CA-mutant EG är synligt vascularized inom 7\u20129 dagar efter injektion och rekapitulera histopatologiska funktioner av VM patient vävnad. Denna VM xenograft modell ger en tillförlitlig plattform för att undersöka de cellulära och molekylära mekanismer som driver VM-formation och expansion. Dessutom kommer denna modell att vara avgörande för translationella studier testa effekten av nya läkemedelskandidater för att förhindra den onormala kärl utvidgningen ses i mänskliga VM.
Introduction
Defekter i utvecklingen av vasculature är den bakomliggande orsaken till många sjukdomar inklusive venous missbildning (VM). VM är en medfödd sjukdom som kännetecknas av onormal morfogenes och expansion av vener1. Viktiga studier på VM-vävnad och endotelceller (EC) har identifierat gain-of-function mutationer i två gener: TEK, som kodar tyrosinkinasreceptorn TIE2, och PIK3CA, som kodar p110α (katalytisk subenhet) isoform av PI3-kinas (PI3K)2,3,4,5. Dessa somatiska mutationer resulterar i ligand-oberoende hyperaktivering av viktiga angiogena/tillväxtsignaleringsvägar, inklusive PI3K/AKT, och resulterar därigenom i dilaterade ektatiska vener3. Trots dessa viktiga genetiska upptäckter, de efterföljande cellulära och molekylära mekanismerna utlöser onormal angiogenes och bildandet av utvidgade Vaskulär kanaler är fortfarande inte helt klarlagda.
Under normal och patologisk angiogenes, nya fartyg gro från en redan existerande vaskulär nätverk och EG genomgår en sekvens av viktiga cellulära processer inklusive spridning, migration, extracellulär matris (ECM) ombyggnad och lumenbildning6. Två- och tredimensionella (2D/3D) in vitro kulturer av EG är viktiga verktyg för att undersöka var och en av dessa cellulära egenskaper individuellt. Trots detta finns det en tydlig efterfrågan på en musmodell som rekapitulerar patologiska fartygsförstoring inom värdmikromiljöen samtidigt som den utgör en effektiv plattform för preklinisk utvärdering av riktade läkemedel för translationell forskning.
Upp till datum, en transgenic murine modell av VM är associerad med TIE2 gain-of-function mutationer har inte rapporterats. Nuvarande transgena VM musmodeller förlitar sig på det allestädes närvarande eller vävnadsbegränsade uttrycket för den aktiverande mutationen PIK3CA p.H1047R3,5. Dessa transgena djur ger betydande insikt i hela kroppen eller vävnadsspecifika effekter av denna hotspot PIK3CA mutation. Begränsningen av dessa modeller är bildandet av ett mycket patologiskt vaskulärt nätverk som resulterar i tidig dödlighet. Således återspeglar dessa musmodeller inte helt den sporadiska förekomsten av mutationella händelser och lokaliserad karaktär VM patologi.
Tvärtom är modeller med patienthärledd xenograft baserad på transplantation eller injektion av patologisk vävnad eller celler som härrör från patienter till immunficienta möss7. Xenograft modeller är ett kraftfullt verktyg för att bredda kunskapen om sjukdomsutveckling och upptäckt av nya terapeutiska medel8. Dessutom, med hjälp av patient-härledda celler tillåter forskare att rekapitulera mutation heterogenitet att studera spektrumet av patientens fenotyper.
Här beskriver vi ett protokoll där patient-härledda VM EG som uttrycker en mutant konstitutivt-aktiv form av TIE2 och/eller PIK3CA injiceras subkutant i baksidan av athymic naken möss. Injicerade vaskulära celler är upphängda i en ECM-ram för att främja angiogenes enligt beskrivningen i tidigare vaskulära xenograft-modeller9,10,11. Dessa VM EG genomgå betydande morfogenes och generera utvidgade, perfused patologiska fartyg i avsaknad av stödjande celler. Den beskrivna xenograft-modellen av virtuell dator ger en effektiv plattform för preklinisk utvärdering av riktade läkemedel för deras förmåga att hämma okontrollerad lumen expansion.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här beskriver vi en metod för att generera en patient-härledda xenograft modell av VM. Denna murine modell presenterar ett utmärkt system som gör det möjligt för forskare att få en djupare förståelse för patologiska lumen utvidgningen och kommer att vara avgörande för att utveckla effektivare och riktade terapier för behandling av VM. Detta kan enkelt anpassas för att undersöka andra typer av vaskulära anomalier såsom kapillärlymfatisk venös missbildning16. Det finns flera steg…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Nora Lakes för korrekturläsning. Forskning som rapporterats i detta manuskript stöddes av National Heart, Lung, och Blood Institute, under Award Number R01 HL117952 (E.B.), en del av National Institutes of Health. Innehållet är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis de officiella åsikterna från National Institutes of Health.
Materials
| Athymic nude mice, (Foxn1-nu); 5-6 weeks, males | Envigo | 069(nu)/070(nu/+) | Subcutaneous injection |
| Biotinylated Ulex europeaus Agglutinin-I (UEA-I) | Vector Laboratories | B-1065 | Histological anlaysis |
| Bottle top filter (500 ml; 0.2 µM) | Thermo Fisher | 974106 | Cell culture |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | BSA | A7906-50MG | Cell culture; Histological analysis |
| Calcium cloride dihydrate (CaCl2.2H2O) | Sigma | C7902-500G | Cell culture |
| Caliper | Electron Microscopy Sciences | 50996491 | Lesion plug measurment |
| CD31-conjugated magnetic beads (Dynabeads) | Life Technologies | 11155D | EC separation |
| Cell strainer (100 μM) | Greiner | 542000 | Cell culture |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | Cell culture |
| Conical Tube; polypropylene (15 mL) | Greiner | 07 000 241 | Cell culture |
| Conical Tube; polypropylene (50 mL) | Greiner | 07 000 239 | Cell culture |
| Coplin staining jar | Ted Pella | 21029 | Histological anlaysis |
| Coverglass (50 X 22 mm) | Fisher Scientific | 12545E | Histological anlaysis |
| DAB: 3,3'Diaminobenzidine Reagent (ImmPACT DAB) | Vector Laboratories | SK-4105 | Histological anlaysis |
| Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM) | Corning | 10-027-CV | Cell culture |
| DynaMag-2 | Life Technologies | 12321D | EC separation |
| Ear punch | VWR | 10806-286 | Subcutaneous injection |
| EDTA (0.5M, pH 8.0) | Life Technologies | 15575-020 | Histological anlaysis |
| Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM2) Bulletkit (basal medium and supplements) | Lonza | CC-3162 | Cell culture |
| Eosin Y (alcohol-based) | Thermo Scientific | 71211 | Histological anlaysis |
| Ethanol | Decon Labs | 2716 | Histological anlaysis |
| Fetal Bovine Serum (FBS) , HyClone | GE Healthcare | SH30910.03 | Cell culture |
| Filter tip 1,250 μL | MidSci | AV1250-H | Multiple steps |
| Filter tip 20 μL | VWR | 10017-064 | Multiple steps |
| Filter tip 200 μL | VWR | 10017-068 | Multiple steps |
| Formalin buffered solution (10%) | Sigma | F04586 | Lesion plug dissection |
| Hemacytometer (INCYTO; Disposable) | SKC FILMS | DHCN015 | Cell culture |
| Hematoxylin | Vector Hematoxylin | H-3401 | Histological anlaysis |
| Human plasma fibronectin purified protein (1mg/mL) | Sigma | FC010-10MG | Cell culture |
| Hydrogen Peroxide solution (30% w/w) | Sigma | H1009 | Histological anlaysis |
| ImageJ Software | Analysis | ||
| Isoflurane, USP | Akorn Animal Health | 59399-106-01 | Subcutaneous injection |
| magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Sigma | M1880-500G | Cell culture |
| Basement Membrane Matrix (Phenol Red-Free; LDEV-free) | Corning | 356237 | Subcutaneous injection |
| Microcentrifuge tube (1.5 mL) | VWR | 87003-294 | EC separation |
| Microscope Slide Superfrost (75mm X 25mm) | Fisher Scientific | 1255015-CS | Histological anlaysis |
| Needles, 26G x 5/8 inch Sub-Q sterile needles | Becton Dickinson (BD) | BD305115 | Subcutaneous injection |
| Normal horse serum | Vector Laboratories | S-2000 | Histological anlaysis |
| Penicillin-Streptomycin-L-Glutamine (100X) | Corning | 30-009-CI | Cell culture |
| Permanent mounting medium (VectaMount) | Vector Laboratories | H-5000 | Histological anlaysis |
| Pestle Size C, Plain | Thomas Scientific | 3431F55 | EC isolation |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3994 | Cell culture |
| Scale | VWR | 65500-202 | Subcutaneous injection |
| Serological pipettes (10 ml) | VWR | 89130-898 | Cell culture |
| Serological pipettes (5ml) | VWR | 89130-896 | Cell culture |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Sigma | 223530 | Cell culture |
| Streptavidin, Horseradish Peroxidase, Concentrate, for IHC | Vector Laboratories | SA-5004 | Cell culture |
| Syringe (60ml) | BD Biosciences | 309653 | Cel culture |
| SYRINGE FILTER (0.2 µM) | Corning | 431219 | Cell culture |
| Syringes (1 mL with Luer Lock) | Becton Dickinson (BD) | BD-309628 | Subcutaneous injection |
| Tissue culture-treated plate (100 X 20 mm) | Greiner | 664160 | Cell culture |
| Tissue culture-treated plate (145X20 mm) | Greiner | 639160 | Cell culture |
| Tissue culture-treated plates (60 X 15) mm | Eppendorf | 30701119 | Cell culture |
| Tris-base (Trizma base) | Sigma | T6066 | Histological anlaysis |
| Trypan Blue Solution (0.4 %) | Life Technologies | 15250061 | Cell culture |
| Trypsin EDTA, 1X (0.05% Trypsin/0.53mM EDTA) | Corning | 25-052-Cl | Cell culture |
| Tween-20 | Biorad | 170-6531 | Histological anlaysis |
| Wheaton bottle | VWR | 16159-798 | Cell culture |
| Xylenes | Fisher Scientific | X3P-1GAL | Histological anlaysis |
References
- Dompmartin, A., Vikkula, M., Boon, L. M. Venous malformation: update on aetiopathogenesis, diagnosis and management. Phlebology: The Journal of Venous Disease. 25 (5), 224-235 (2010).
- Limaye, N., et al. Somatic mutations in angiopoietin receptor gene TEK cause solitary and multiple sporadic venous malformations. Nature Genetics. 41 (1), 118-124 (2009).
- Castel, P., et al. Somatic PIK3CA mutations as a driver of sporadic venous malformations. Science Translational Medicine. 8 (332), 42 (2016).
- Limaye, N., et al. Somatic Activating PIK3CA Mutations Cause Venous Malformation. The American Journal of Human Genetics. 97 (6), 914-921 (2015).
- Castillo, S. D., et al. Somatic activating mutations in Pik3ca cause sporadic venous malformations in mice and humans. Science Translational Medicine. 8 (332), 43 (2016).
- Stratman, A. N., et al. Endothelial cell lumen and vascular guidance tunnel formation requires MT1-MMP-dependent proteolysis in 3-dimensional collagen matrices. Blood. 114 (2), 237-247 (2009).
- Okada, S., Vaeteewoottacharn, K., Kariya, R. Application of Highly Immunocompromised Mice for the Establishment of Patient-Derived Xenograft (PDX) Models. Cells. 8 (8), 889 (2019).
- Byrne, A. T., et al. Interrogating open issues in cancer precision medicine with patient-derived xenografts. Nature Reviews Cancer. 17 (4), 254-268 (2017).
- Allen, P., Melero-Martin, J., Bischoff, J. Type I collagen, fibrin and PuraMatrix matrices provide permissive environments for human endothelial and mesenchymal progenitor cells to form neovascular networks. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5 (4), 74 (2011).
- Allen, P., Kang, K. T., Bischoff, J. Rapid onset of perfused blood vessels after implantation of ECFCs and MPCs in collagen, PuraMatrix and fibrin provisional matrices. Journal of Tissue Engineering and Regenerative. 9 (5), 632-636 (2015).
- Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425 (2018).
- Roh, Y. N., et al. The results of surgical treatment for patients with venous malformations. Annals of Vascular Surgery. 26 (5), 665-673 (2012).
- Marler, J. J., Mulliken, J. B. Current management of hemangiomas and vascular malformations. Clinics in Plastic Surgery. 32 (1), 99-116 (2005).
- Goines, J., et al. A xenograft model for venous malformation. Angiogenesis. 21 (4), 725-735 (2018).
- Li, X., et al. Ponatinib Combined With Rapamycin Causes Regression of Murine Venous Malformation. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 39 (3), 496-512 (2019).
- Le Cras, T. D., et al. Constitutively active PIK3CA mutations are expressed by lymphatic and vascular endothelial cells in capillary lymphatic venous malformation. Angiogenesis. , 1-18 (2020).
- Boscolo, E., et al. Rapamycin improves TIE2-mutated venous malformation in murine model and human subjects. Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3491-3504 (2015).
