En Patient-Afledt Xenograft Model for Venøs misdannelser
Summary
Vi præsenterer en detaljeret protokol til at generere en murine xenograft model af venøs misdannelser. Denne model er baseret på subkutan injektion af patientbaserede endotelceller, der indeholder hyperaktiverende TIE2- og/eller PIK3CA-genmutationer. Xenograft læsioner nøje opsummere de histopatologiske træk ved VM patientvæv.
Abstract
Venøs misdannelse (VM) er en vaskulær anomali, der opstår fra nedsat udvikling af venøs netværk resulterer i udvidede og ofte dysfunktionelle vener. Formålet med denne artikel er omhyggeligt at beskrive etableringen af en murine xenograft model, der efterligner menneskelige VM og er i stand til at afspejle patientens heterogenitet. Hyperaktiverende ikke-nedarvede (somatiske) TEK -mutationer (TIE2) og PIK3CA-mutationer i endotelceller (EF) er blevet identificeret som de vigtigste drivkræfter bag den patologiske fartøjsudvidelse i VM. Følgende protokol beskriver isolering, rensning og udvidelse af patientudledt EF, der udtrykker mutant TIE2 og/eller PIK3CA. Disse EF injiceres subkutisk ind i ryggen af immundefekt athymiske mus for at generere ectatic vaskulære kanaler. Læsioner genereret med TIE2 eller PIK3CA-mutant EF er synligt vaskulariseret inden for 7\u20129 dage efter injektion og opsummere histopatologiske træk af VM patientvæv. Denne VM xenograft model giver en pålidelig platform til at undersøge de cellulære og molekylære mekanismer, der driver VM-dannelse og -udvidelse. Desuden vil denne model være afgørende for translationelle undersøgelser teste effekten af nye lægemiddel kandidater i at forhindre den unormale fartøj udvidelsen set i menneskelige VM.
Introduction
Defekter i udviklingen af vaskulaturen er den underliggende årsag til mange sygdomme, herunder venøs misdannelser (VM). VM er en medfødt sygdom karakteriseret ved unormal morfogenese og udvidelse af vener1. Vigtige undersøgelser af VM-væv og endotelceller (EF) har identificeret funktionsgevinster i to gener: TEK, som koder tyrosinkinasereceptoren TIE2, og PIK3CA, som koder p110α (katalytisk underenhed) isoform af PI3-kinase (PI3K) 2,33,4,5. Disse somatiske mutationer resulterer i ligand-uafhængig hyper-aktivering af centrale angiogene/ vækst signalering veje, herunder PI3K / AKT, hvilket resulterer i udvidede ektatiske vener3. På trods af disse vigtige genetiske opdagelser, de efterfølgende cellulære og molekylære mekanismer udløser unormal angiogenese og dannelsen af udvidede vaskulære kanaler er stadig ikke fuldt forstået.
Under normal og patologisk angiogenese spirer nye fartøjer fra et allerede eksisterende vaskulært netværk, og EF gennemgår en række vigtige cellulære processer, herunder spredning, migration, ekstracellulær matrix (ECM) remodeling og lumendannelse6. To- og tredimensionelle (2D/3D) in vitro-kulturer i EF er vigtige værktøjer til at undersøge hver af disse cellulære egenskaber individuelt. Ikke desto mindre er der en klar efterspørgsel efter en musemodel, der opsummerer den patologiske fartøjsudvidelse inden for værtsmikro miljøet, samtidig med at der skabes en effektiv platform for præklinisk evaluering af målrettede lægemidler til translationel forskning.
Ajour, en transgen murine model af VM forbundet med TIE2 gain-of-function mutationer er ikke blevet rapporteret. De nuværende transgene VM-musemodeller er afhængige af det allestedsnærværende eller vævsbegrænsede udtryk for den aktiverende mutation PIK3CA p.H1047R3,5. Disse transgene dyr giver betydelig indsigt i hele kroppen eller vævsspecifikke virkninger af denne hotspot PIK3CA-mutation. Begrænsningen af disse modeller er dannelsen af et meget patologisk vaskulært netværk, der resulterer i tidlig dødelighed. Således afspejler disse musemodeller ikke fuldt ud den sporadiske forekomst af mutationshændelser og lokaliseret karakter af VM-patologi.
Tværtimod er patientbaserede xenograftmodeller baseret på transplantation eller injektion af patologisk væv eller celler fra patienter til immundefekte mus7. Xenograft modeller er et effektivt redskab til at udvide viden om sygdomsudvikling og opdagelsen af nye terapeutiske midler8. Ved hjælp af patientafledte celler kan forskerne desuden opsummere mutationsdomogeniteten for at studere spektret af patientfænotyper.
Her beskriver vi en protokol, hvor patient-afledt VM EF, som udtrykker en mutant konstituerende aktiv form for TIE2 og / eller PIK3CA injiceres subkutant i ryggen af athymiske nøgenmus. Indsprøjtede vaskulære celler suspenderes i en ECM-ramme for at fremme angiogenese som beskrevet i tidligere vaskulære xenograftmodeller9,10,11. Disse VM EF gennemgår betydelig morfogenese og genererer forstørrede, perfunderede patologiske fartøjer i mangel af understøttende celler. Den beskrevne xenograft model af VM giver en effektiv platform for præklinisk evaluering af målrettede lægemidler for deres evne til at hæmme ukontrolleret lumen ekspansion.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskriver vi en metode til at generere en patient-afledt xenograft model af VM. Denne murine model præsenterer et fremragende system, der giver forskerne mulighed for at få en dybere forståelse af patologiske lumen udvidelsen og vil være medvirkende til at udvikle mere effektive og målrettede behandlinger til behandling af VM. Dette kan let tilpasses til at undersøge andre typer af vaskulære anomalier såsom kapillær lymfevens misdannelse16. Der er flere trin, der er afgørende for den…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke Nora Lakes for korrekturlæsning. Forskning rapporteret i dette manuskript blev støttet af National Heart, Lung, og Blood Institute, under Award Number R01 HL117952 (E.B.), en del af National Institutes of Health. Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter fra de nationale sundhedsinstitutter.
Materials
| Athymic nude mice, (Foxn1-nu); 5-6 weeks, males | Envigo | 069(nu)/070(nu/+) | Subcutaneous injection |
| Biotinylated Ulex europeaus Agglutinin-I (UEA-I) | Vector Laboratories | B-1065 | Histological anlaysis |
| Bottle top filter (500 ml; 0.2 µM) | Thermo Fisher | 974106 | Cell culture |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | BSA | A7906-50MG | Cell culture; Histological analysis |
| Calcium cloride dihydrate (CaCl2.2H2O) | Sigma | C7902-500G | Cell culture |
| Caliper | Electron Microscopy Sciences | 50996491 | Lesion plug measurment |
| CD31-conjugated magnetic beads (Dynabeads) | Life Technologies | 11155D | EC separation |
| Cell strainer (100 μM) | Greiner | 542000 | Cell culture |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | Cell culture |
| Conical Tube; polypropylene (15 mL) | Greiner | 07 000 241 | Cell culture |
| Conical Tube; polypropylene (50 mL) | Greiner | 07 000 239 | Cell culture |
| Coplin staining jar | Ted Pella | 21029 | Histological anlaysis |
| Coverglass (50 X 22 mm) | Fisher Scientific | 12545E | Histological anlaysis |
| DAB: 3,3'Diaminobenzidine Reagent (ImmPACT DAB) | Vector Laboratories | SK-4105 | Histological anlaysis |
| Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM) | Corning | 10-027-CV | Cell culture |
| DynaMag-2 | Life Technologies | 12321D | EC separation |
| Ear punch | VWR | 10806-286 | Subcutaneous injection |
| EDTA (0.5M, pH 8.0) | Life Technologies | 15575-020 | Histological anlaysis |
| Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM2) Bulletkit (basal medium and supplements) | Lonza | CC-3162 | Cell culture |
| Eosin Y (alcohol-based) | Thermo Scientific | 71211 | Histological anlaysis |
| Ethanol | Decon Labs | 2716 | Histological anlaysis |
| Fetal Bovine Serum (FBS) , HyClone | GE Healthcare | SH30910.03 | Cell culture |
| Filter tip 1,250 μL | MidSci | AV1250-H | Multiple steps |
| Filter tip 20 μL | VWR | 10017-064 | Multiple steps |
| Filter tip 200 μL | VWR | 10017-068 | Multiple steps |
| Formalin buffered solution (10%) | Sigma | F04586 | Lesion plug dissection |
| Hemacytometer (INCYTO; Disposable) | SKC FILMS | DHCN015 | Cell culture |
| Hematoxylin | Vector Hematoxylin | H-3401 | Histological anlaysis |
| Human plasma fibronectin purified protein (1mg/mL) | Sigma | FC010-10MG | Cell culture |
| Hydrogen Peroxide solution (30% w/w) | Sigma | H1009 | Histological anlaysis |
| ImageJ Software | Analysis | ||
| Isoflurane, USP | Akorn Animal Health | 59399-106-01 | Subcutaneous injection |
| magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Sigma | M1880-500G | Cell culture |
| Basement Membrane Matrix (Phenol Red-Free; LDEV-free) | Corning | 356237 | Subcutaneous injection |
| Microcentrifuge tube (1.5 mL) | VWR | 87003-294 | EC separation |
| Microscope Slide Superfrost (75mm X 25mm) | Fisher Scientific | 1255015-CS | Histological anlaysis |
| Needles, 26G x 5/8 inch Sub-Q sterile needles | Becton Dickinson (BD) | BD305115 | Subcutaneous injection |
| Normal horse serum | Vector Laboratories | S-2000 | Histological anlaysis |
| Penicillin-Streptomycin-L-Glutamine (100X) | Corning | 30-009-CI | Cell culture |
| Permanent mounting medium (VectaMount) | Vector Laboratories | H-5000 | Histological anlaysis |
| Pestle Size C, Plain | Thomas Scientific | 3431F55 | EC isolation |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3994 | Cell culture |
| Scale | VWR | 65500-202 | Subcutaneous injection |
| Serological pipettes (10 ml) | VWR | 89130-898 | Cell culture |
| Serological pipettes (5ml) | VWR | 89130-896 | Cell culture |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Sigma | 223530 | Cell culture |
| Streptavidin, Horseradish Peroxidase, Concentrate, for IHC | Vector Laboratories | SA-5004 | Cell culture |
| Syringe (60ml) | BD Biosciences | 309653 | Cel culture |
| SYRINGE FILTER (0.2 µM) | Corning | 431219 | Cell culture |
| Syringes (1 mL with Luer Lock) | Becton Dickinson (BD) | BD-309628 | Subcutaneous injection |
| Tissue culture-treated plate (100 X 20 mm) | Greiner | 664160 | Cell culture |
| Tissue culture-treated plate (145X20 mm) | Greiner | 639160 | Cell culture |
| Tissue culture-treated plates (60 X 15) mm | Eppendorf | 30701119 | Cell culture |
| Tris-base (Trizma base) | Sigma | T6066 | Histological anlaysis |
| Trypan Blue Solution (0.4 %) | Life Technologies | 15250061 | Cell culture |
| Trypsin EDTA, 1X (0.05% Trypsin/0.53mM EDTA) | Corning | 25-052-Cl | Cell culture |
| Tween-20 | Biorad | 170-6531 | Histological anlaysis |
| Wheaton bottle | VWR | 16159-798 | Cell culture |
| Xylenes | Fisher Scientific | X3P-1GAL | Histological anlaysis |
References
- Dompmartin, A., Vikkula, M., Boon, L. M. Venous malformation: update on aetiopathogenesis, diagnosis and management. Phlebology: The Journal of Venous Disease. 25 (5), 224-235 (2010).
- Limaye, N., et al. Somatic mutations in angiopoietin receptor gene TEK cause solitary and multiple sporadic venous malformations. Nature Genetics. 41 (1), 118-124 (2009).
- Castel, P., et al. Somatic PIK3CA mutations as a driver of sporadic venous malformations. Science Translational Medicine. 8 (332), 42 (2016).
- Limaye, N., et al. Somatic Activating PIK3CA Mutations Cause Venous Malformation. The American Journal of Human Genetics. 97 (6), 914-921 (2015).
- Castillo, S. D., et al. Somatic activating mutations in Pik3ca cause sporadic venous malformations in mice and humans. Science Translational Medicine. 8 (332), 43 (2016).
- Stratman, A. N., et al. Endothelial cell lumen and vascular guidance tunnel formation requires MT1-MMP-dependent proteolysis in 3-dimensional collagen matrices. Blood. 114 (2), 237-247 (2009).
- Okada, S., Vaeteewoottacharn, K., Kariya, R. Application of Highly Immunocompromised Mice for the Establishment of Patient-Derived Xenograft (PDX) Models. Cells. 8 (8), 889 (2019).
- Byrne, A. T., et al. Interrogating open issues in cancer precision medicine with patient-derived xenografts. Nature Reviews Cancer. 17 (4), 254-268 (2017).
- Allen, P., Melero-Martin, J., Bischoff, J. Type I collagen, fibrin and PuraMatrix matrices provide permissive environments for human endothelial and mesenchymal progenitor cells to form neovascular networks. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5 (4), 74 (2011).
- Allen, P., Kang, K. T., Bischoff, J. Rapid onset of perfused blood vessels after implantation of ECFCs and MPCs in collagen, PuraMatrix and fibrin provisional matrices. Journal of Tissue Engineering and Regenerative. 9 (5), 632-636 (2015).
- Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425 (2018).
- Roh, Y. N., et al. The results of surgical treatment for patients with venous malformations. Annals of Vascular Surgery. 26 (5), 665-673 (2012).
- Marler, J. J., Mulliken, J. B. Current management of hemangiomas and vascular malformations. Clinics in Plastic Surgery. 32 (1), 99-116 (2005).
- Goines, J., et al. A xenograft model for venous malformation. Angiogenesis. 21 (4), 725-735 (2018).
- Li, X., et al. Ponatinib Combined With Rapamycin Causes Regression of Murine Venous Malformation. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 39 (3), 496-512 (2019).
- Le Cras, T. D., et al. Constitutively active PIK3CA mutations are expressed by lymphatic and vascular endothelial cells in capillary lymphatic venous malformation. Angiogenesis. , 1-18 (2020).
- Boscolo, E., et al. Rapamycin improves TIE2-mutated venous malformation in murine model and human subjects. Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3491-3504 (2015).
