정맥 기형에 대한 환자 유래 제노이식 모델
Summary
우리는 정맥 기형의 뮤린 xenograft 모형을 생성하는 상세한 프로토콜을 제시합니다. 본 모델은 하이퍼 활성화 TIE2 및/또는 PIK3CA 유전자 돌연변이를 포함하는 환자 유래 내피 세포의 피하 주입을 기반으로 한다. Xenograft 병변은 VM 환자 조직의 조직 병리학적 특징을 밀접하게 재구성합니다.
Abstract
정맥 기형 (VM)은 혈관 이상으로 정맥 네트워크의 손상된 발달로 인해 팽창되고 종종 기능 장애 정맥이 발생합니다. 이 문서의 목적은 인간 VM을 모방하고 환자 이질성을 반영할 수 있는 뮤린 이노이식 모델의 확립을 신중하게 설명하는 것입니다. 내피 세포(EC)에서 의학적 유전(체혈) TEK(TIE2) 및 PIK3CA 돌연변이를 하이퍼 활성화시키는 것은 VM에서 병리학적 혈관 확대의 주요 동인으로 확인되었다. TEK 다음 프로토콜은 돌연변이 TIE2 및/또는 PIK3CA를 발현하는 환자 유래 EC의 격리, 정제 및 확장을 설명합니다. 이 EC는 면역 절제성 자티믹 마우스의 뒤쪽으로 피하주사되어 유방 혈관 채널을 생성합니다. TIE2 또는 PIK3CA 돌연변이 EC로 생성된 병변은 VM 환자 조직의 주입 및 조직 병리학적 특징을 재구성한 7\u20129 일 이내에 눈에 띄게 혈관화된다. 이 VM 제노이식 모델은 VM 형성 및 확장을 주도하는 세포 및 분자 메커니즘을 조사하는 신뢰할 수 있는 플랫폼을 제공합니다. 또한, 본 모델은 인간 VM에서 볼 수 있는 비정상적인 혈관 확대를 방지하는 새로운 약물 후보의 효능을 시험하는 번역 연구에 도움이 될 것이다.
Introduction
혈관의 발달에 있는 결점은 정맥 기형 (VM)를 포함하여 많은 질병의 근본 원인입니다. VM은 비정상적인 형태 발생 및 정맥1의확장을 특징으로 하는 선천성 질환이다. VM 조직 및 내피 세포 (EC)에 대한 중요한 연구는 두 가지 유전자에서 게인 돌연변이를 확인했습니다 : 티로신 키나아제 수용체 TIE2를 인코딩하는 TEK과 PIK3CA는PI3-kinase (PI3K),2,3,,4,5의p110α (촉매 하위 단위)를 인코딩합니다. 이러한 체세포 돌연변이는 PI3K/AKT를 포함한 주요 혈관신생/성장 신호 경로의 리간드 독립적인 하이퍼 활성화를 초래하여 3개의 압자정맥을3팽창시키는 결과를 낳는다. 이러한 중요한 유전 적 발견에도 불구하고 비정상적인 혈관 신생 및 확대 된 혈관 채널의 형성을 유발하는 후속 세포 및 분자 메커니즘은 여전히 완전히 이해되지 않습니다.
정상 및 병리학 적 혈관 신생 동안, 기존의 혈관 네트워크 및 EC에서 새로운 혈관싹증증증, 마이그레이션, 세포 외 매트릭스 (ECM) 리모델링 및 루멘 형성6을포함하는 중요한 세포 과정의 순서를 겪는다. EC의 체외 배양에서 2차원 및 3차원(2D/3D)은 이러한 각 셀룰러 특성을 개별적으로 조사하는 중요한 도구입니다. 그럼에도 불구하고, 마우스 모델에 대한 명확한 요구가 호스트 미세 환경 내에서 병리학 적 혈관 확대를 회수하면서 번역 연구를위한 표적 약물의 전임상 평가를위한 효율적인 플랫폼을 제공.
현재까지 TIE2 게인-기능 돌연변이와 관련된 VM의 형질전환 모린 모델은 보고되지 않았다. 현재 형질전환 VM 마우스 모델은 활성화 돌연변이 PIK3CA p.H1047R3,,5의유비쿼터스 또는 조직 제한 발현에 의존한다. 이 형질 전환 동물은 이 핫스팟 PIK3CA 돌연변이의 전신 또는 조직 특정 효력에 중요한 통찰력을 제공합니다. 이 모형의 한계는 초기 치사성의 결과로 높게 병리학적인 혈관 네트워크의 형성입니다. 따라서, 이러한 마우스 모델은 VM 병리학의 돌연변이 이벤트 및 국소화된 성질의 산발적 발생을 완전히 반영하지 않는다.
반대로, 환자 유래 이종이이식 모델은 환자로부터 유래한 병리학적 조직 또는 세포의 이식 또는 주입에 기초하여 면역결핍 마우스7을포함한다. 제노이식 모델은 새로운 치료제8의질병 발달 및 발견에 대한 지식을 넓히는 강력한 도구이다. 또한, 환자 유래 세포를 사용하면 과학자들이 돌연변이 이질성을 재구성하여 환자 표현형의 스펙트럼을 연구할 수 있습니다.
여기서는, 우리는 자티믹 누드 마우스의 뒷면에 피하로 주입되는 TIE2 및/또는 PIK3CA의 돌연변이 성분 활성 형태를 표현하는 환자 유래 VM EC가 피하되는 프로토콜을 기술합니다. 주입된 혈관 세포는 이전 혈관 이종이이식 모델9,,10,,11에기술된 바와 같이 혈관 신생을 촉진하기 위해 ECM 프레임워크에서 중단된다. 이러한 VM EC는 중요한 형태 발생을 겪고 지원 세포의 부재에 확대, perfused 병리학 혈관을 생성합니다. VM의 설명된 xenograft 모델은 통제되지 않은 루멘 확장을 억제하는 능력에 대한 표적 약물의 전임상 평가를 위한 효율적인 플랫폼을 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기서는 VM의 환자 유래 이노이식 모델을 생성하는 방법을 설명합니다. 이 뮤린 모델은 연구원이 병리학적인 루멘 확대에 대한 깊은 이해를 얻을 수 있게 해주는 우수한 시스템을 제시하며 VM 치료를 위한 보다 효과적이고 표적화된 치료법을 개발하는 데 중요한 역할을 할 것입니다. 이것은 모세관 림프 정맥 기형(16)과같은 혈관 이상의 그밖 모형을 조사하기 위하여 쉽게 적응될…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 교정노라 레이크에 감사드립니다. 이 원고에서 보고된 연구는 국립 심장, 폐 및 혈액 연구소에 의해 지원되었다, 수상 번호 R01 HL117952 (E.B.), 건강의 국립 연구소의 일부. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.
Materials
| Athymic nude mice, (Foxn1-nu); 5-6 weeks, males | Envigo | 069(nu)/070(nu/+) | Subcutaneous injection |
| Biotinylated Ulex europeaus Agglutinin-I (UEA-I) | Vector Laboratories | B-1065 | Histological anlaysis |
| Bottle top filter (500 ml; 0.2 µM) | Thermo Fisher | 974106 | Cell culture |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | BSA | A7906-50MG | Cell culture; Histological analysis |
| Calcium cloride dihydrate (CaCl2.2H2O) | Sigma | C7902-500G | Cell culture |
| Caliper | Electron Microscopy Sciences | 50996491 | Lesion plug measurment |
| CD31-conjugated magnetic beads (Dynabeads) | Life Technologies | 11155D | EC separation |
| Cell strainer (100 μM) | Greiner | 542000 | Cell culture |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | Cell culture |
| Conical Tube; polypropylene (15 mL) | Greiner | 07 000 241 | Cell culture |
| Conical Tube; polypropylene (50 mL) | Greiner | 07 000 239 | Cell culture |
| Coplin staining jar | Ted Pella | 21029 | Histological anlaysis |
| Coverglass (50 X 22 mm) | Fisher Scientific | 12545E | Histological anlaysis |
| DAB: 3,3'Diaminobenzidine Reagent (ImmPACT DAB) | Vector Laboratories | SK-4105 | Histological anlaysis |
| Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM) | Corning | 10-027-CV | Cell culture |
| DynaMag-2 | Life Technologies | 12321D | EC separation |
| Ear punch | VWR | 10806-286 | Subcutaneous injection |
| EDTA (0.5M, pH 8.0) | Life Technologies | 15575-020 | Histological anlaysis |
| Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM2) Bulletkit (basal medium and supplements) | Lonza | CC-3162 | Cell culture |
| Eosin Y (alcohol-based) | Thermo Scientific | 71211 | Histological anlaysis |
| Ethanol | Decon Labs | 2716 | Histological anlaysis |
| Fetal Bovine Serum (FBS) , HyClone | GE Healthcare | SH30910.03 | Cell culture |
| Filter tip 1,250 μL | MidSci | AV1250-H | Multiple steps |
| Filter tip 20 μL | VWR | 10017-064 | Multiple steps |
| Filter tip 200 μL | VWR | 10017-068 | Multiple steps |
| Formalin buffered solution (10%) | Sigma | F04586 | Lesion plug dissection |
| Hemacytometer (INCYTO; Disposable) | SKC FILMS | DHCN015 | Cell culture |
| Hematoxylin | Vector Hematoxylin | H-3401 | Histological anlaysis |
| Human plasma fibronectin purified protein (1mg/mL) | Sigma | FC010-10MG | Cell culture |
| Hydrogen Peroxide solution (30% w/w) | Sigma | H1009 | Histological anlaysis |
| ImageJ Software | Analysis | ||
| Isoflurane, USP | Akorn Animal Health | 59399-106-01 | Subcutaneous injection |
| magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Sigma | M1880-500G | Cell culture |
| Basement Membrane Matrix (Phenol Red-Free; LDEV-free) | Corning | 356237 | Subcutaneous injection |
| Microcentrifuge tube (1.5 mL) | VWR | 87003-294 | EC separation |
| Microscope Slide Superfrost (75mm X 25mm) | Fisher Scientific | 1255015-CS | Histological anlaysis |
| Needles, 26G x 5/8 inch Sub-Q sterile needles | Becton Dickinson (BD) | BD305115 | Subcutaneous injection |
| Normal horse serum | Vector Laboratories | S-2000 | Histological anlaysis |
| Penicillin-Streptomycin-L-Glutamine (100X) | Corning | 30-009-CI | Cell culture |
| Permanent mounting medium (VectaMount) | Vector Laboratories | H-5000 | Histological anlaysis |
| Pestle Size C, Plain | Thomas Scientific | 3431F55 | EC isolation |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3994 | Cell culture |
| Scale | VWR | 65500-202 | Subcutaneous injection |
| Serological pipettes (10 ml) | VWR | 89130-898 | Cell culture |
| Serological pipettes (5ml) | VWR | 89130-896 | Cell culture |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Sigma | 223530 | Cell culture |
| Streptavidin, Horseradish Peroxidase, Concentrate, for IHC | Vector Laboratories | SA-5004 | Cell culture |
| Syringe (60ml) | BD Biosciences | 309653 | Cel culture |
| SYRINGE FILTER (0.2 µM) | Corning | 431219 | Cell culture |
| Syringes (1 mL with Luer Lock) | Becton Dickinson (BD) | BD-309628 | Subcutaneous injection |
| Tissue culture-treated plate (100 X 20 mm) | Greiner | 664160 | Cell culture |
| Tissue culture-treated plate (145X20 mm) | Greiner | 639160 | Cell culture |
| Tissue culture-treated plates (60 X 15) mm | Eppendorf | 30701119 | Cell culture |
| Tris-base (Trizma base) | Sigma | T6066 | Histological anlaysis |
| Trypan Blue Solution (0.4 %) | Life Technologies | 15250061 | Cell culture |
| Trypsin EDTA, 1X (0.05% Trypsin/0.53mM EDTA) | Corning | 25-052-Cl | Cell culture |
| Tween-20 | Biorad | 170-6531 | Histological anlaysis |
| Wheaton bottle | VWR | 16159-798 | Cell culture |
| Xylenes | Fisher Scientific | X3P-1GAL | Histological anlaysis |
References
- Dompmartin, A., Vikkula, M., Boon, L. M. Venous malformation: update on aetiopathogenesis, diagnosis and management. Phlebology: The Journal of Venous Disease. 25 (5), 224-235 (2010).
- Limaye, N., et al. Somatic mutations in angiopoietin receptor gene TEK cause solitary and multiple sporadic venous malformations. Nature Genetics. 41 (1), 118-124 (2009).
- Castel, P., et al. Somatic PIK3CA mutations as a driver of sporadic venous malformations. Science Translational Medicine. 8 (332), 42 (2016).
- Limaye, N., et al. Somatic Activating PIK3CA Mutations Cause Venous Malformation. The American Journal of Human Genetics. 97 (6), 914-921 (2015).
- Castillo, S. D., et al. Somatic activating mutations in Pik3ca cause sporadic venous malformations in mice and humans. Science Translational Medicine. 8 (332), 43 (2016).
- Stratman, A. N., et al. Endothelial cell lumen and vascular guidance tunnel formation requires MT1-MMP-dependent proteolysis in 3-dimensional collagen matrices. Blood. 114 (2), 237-247 (2009).
- Okada, S., Vaeteewoottacharn, K., Kariya, R. Application of Highly Immunocompromised Mice for the Establishment of Patient-Derived Xenograft (PDX) Models. Cells. 8 (8), 889 (2019).
- Byrne, A. T., et al. Interrogating open issues in cancer precision medicine with patient-derived xenografts. Nature Reviews Cancer. 17 (4), 254-268 (2017).
- Allen, P., Melero-Martin, J., Bischoff, J. Type I collagen, fibrin and PuraMatrix matrices provide permissive environments for human endothelial and mesenchymal progenitor cells to form neovascular networks. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5 (4), 74 (2011).
- Allen, P., Kang, K. T., Bischoff, J. Rapid onset of perfused blood vessels after implantation of ECFCs and MPCs in collagen, PuraMatrix and fibrin provisional matrices. Journal of Tissue Engineering and Regenerative. 9 (5), 632-636 (2015).
- Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425 (2018).
- Roh, Y. N., et al. The results of surgical treatment for patients with venous malformations. Annals of Vascular Surgery. 26 (5), 665-673 (2012).
- Marler, J. J., Mulliken, J. B. Current management of hemangiomas and vascular malformations. Clinics in Plastic Surgery. 32 (1), 99-116 (2005).
- Goines, J., et al. A xenograft model for venous malformation. Angiogenesis. 21 (4), 725-735 (2018).
- Li, X., et al. Ponatinib Combined With Rapamycin Causes Regression of Murine Venous Malformation. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 39 (3), 496-512 (2019).
- Le Cras, T. D., et al. Constitutively active PIK3CA mutations are expressed by lymphatic and vascular endothelial cells in capillary lymphatic venous malformation. Angiogenesis. , 1-18 (2020).
- Boscolo, E., et al. Rapamycin improves TIE2-mutated venous malformation in murine model and human subjects. Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3491-3504 (2015).
