Summary

Lesión neuronal dirigida para la desconexión no invasiva del circuito cerebral

Published: September 27, 2020
doi:

Summary

El objetivo del protocolo es proporcionar un método para producir lesiones neuronales no invasivas en el cerebro. El método utiliza ultrasonido focalizado guiado por resonancia magnética (MRgFUS) para abrir la barrera hematoencefálica de una manera transitoria y focal, con el fin de entregar una neurotoxina circulante al parénquima cerebral.

Abstract

La intervención quirúrgica puede ser bastante eficaz para tratar ciertos tipos de enfermedades neurológicas médicamente intratables. Este enfoque es particularmente útil para trastornos en los que los circuitos neuronales identificables juegan un papel clave, como la epilepsia y los trastornos del movimiento. Actualmente las modalidades quirúrgicas disponibles, si bien son efectivas, generalmente implican un procedimiento quirúrgico invasivo, que puede resultar en lesiones quirúrgicas a tejidos no objetivo. En consecuencia, sería de valor ampliar la gama de enfoques quirúrgicos para incluir una técnica que no sea invasiva y neurotóxica.

Aquí, se presenta un método para producir lesiones neuronales focales en el cerebro de una manera no invasiva. Este enfoque utiliza ultrasonido enfocado de baja intensidad junto con microburbujas intravenosas para abrir transitoria y focalmente la Barrera Hemáncera (BBB). El período de apertura transitoria de BBB se explota entonces para entregar focalmente una neurotoxina administrada sistémicamente a un área cerebral dirigida. El ácido quinolinico de neurotoxina (QA) es normalmente impermeable a BBB, y es bien tolerado cuando se administra por vía intraperitoneal o intravenosa. Sin embargo, Cuando qa gana acceso directo al tejido cerebral, es tóxico para las neuronas. Este método se ha utilizado en ratas y ratones para apuntar a regiones cerebrales específicas. Inmediatamente después de MRgFUS, la apertura exitosa del BBB se confirma utilizando imágenes ponderadas en T1 mejoradas en contraste. Después del procedimiento, las imágenes T2 muestran una lesión restringida a la zona objetivo del cerebro y la pérdida de neuronas en el área objetivo se puede confirmar post mortem utilizando técnicas histológicas. En particular, los animales inyectados con solución salina en lugar de QA demuestran la apertura del BBB, pero punto no exhiben lesión o pérdida neuronal. Este método, llamado Precise Intracerebral Non-invasive Guided Surgery (PING) podría proporcionar un enfoque no invasivo para el tratamiento de trastornos neurológicos asociados con alteraciones en los circuitos neuronales.

Introduction

El propósito de este método es proporcionar un medio para producir lesiones neuronales no invasivas en una región específica del cerebro. La razón para desarrollar este enfoque es desconectar el circuito neuronal contribuyendo a los trastornos neurológicos. Por ejemplo, la cirugía puede ser bastante eficaz en el tratamiento de ciertos trastornos neurológicos médicamente intratables, como la epilepsia farmacorresistente (DRE)1. Sin embargo, cada una de las modalidades quirúrgicas disponibles posee limitaciones en términos de producir daño colateral indeseable al cerebro. La cirugía resectiva tradicional puede ser altamente invasiva con el riesgo de sangrado, infección, coágulos sanguíneos, accidente cerebrovascular, convulsiones, hinchazón del cerebro y daño a los nervios2. Las alternativas a la cirugía resectiva que son mínimamente invasivas o no invasivas incluyen la terapia térmica intersticial láser y la radiocirugía, que también han demostrado ser eficaces para suprimir las convulsiones en DRE. Más recientemente, las lesiones térmicas producidas por ultrasonido focalizado de alta intensidad (HIFU) han demostrado ser prometedoras en la reducción de las convulsiones. HIFU no es invasivo; sin embargo, su ventana de tratamiento actualmente se limita a áreas más centrales del cerebro debido al riesgo de lesión térmica al tejido no objetivo situado en las proximidades del cráneo. A pesar de estas limitaciones, los beneficios de la cirugía a menudo superan los riesgos potenciales. Por ejemplo, aunque la cirugía para la DRE puede producir daño cerebral colateral, sus efectos beneficiosos en la supresión de las convulsiones y la mejora de la calidad de vida suelen prevalecer sobre los riesgos quirúrgicos.

El método descrito en este documento, Precise Intracerebral Non-invasive Guided surgery (PING), fue desarrollado con el propósito de desconectar los circuitos neuronales, al tiempo que limita el daño cerebral colateral. El método utiliza ultrasonido centrado de baja intensidad combinado con inyección intravenosa de microburbujas para abrir el BBB, con el fin de entregar una neurotoxina. Este enfoque no produce lesiones térmicas al cerebro3,4,5,6,7, y el período de apertura BBB puede ser explotado para entregar BBB-compuestos impermeables al parénquima cerebral. La apertura del BBB es transitoria y se puede producir de manera específica mediante la guía por imágenes por resonancia magnética. En nuestros estudios, el período de apertura de BBB se ha utilizado para entregar una neurotoxina circulante a una zona específica del parénquima cerebral en ratas y ratones8,,9. El ácido quinolinico es una neurotoxina bien tolerada cuando se administra por vía intravenosa10,intraarterialmente10, o intraperitonealmente8,9,11. La falta de toxicidad de control de calidad se debe a su escasa permeabilidad del BBB, que se ha informado de que es insignificante10. Por el contrario, la inyección directa de QA en el parénquima cerebral produce lesiones neuronales que evitan los axones vecinos12,,13. Por lo tanto, cuando el control de calidad circulante obtiene acceso al parénquima cerebral en el área objetivo de la apertura de BBB, la muerte neuronal se produce8,,9. El método actual produce así la pérdida neuronal focal de una manera precisa dirigida y no invasiva.

Protocol

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Virginia. 1. Preparación de reactivos El día de la cirugía, prepare 6,0 ml de ácido quinolinico inyectable (QA). Disolver 450 mg de QA en 4,0 ml de 1,0 N NaOH. Añadir 0,6 ml de 10 veces PBS, pH a 7,4, y llevar a un volumen final de 6,0 ml con dH2O. Filtrar a través de filtro de jeringa de 0,22 m. La solución es estable durante 2 semanas a 4oC. …

Representative Results

Esta sección describe el efecto de PING en las neuronas ubicadas en una displasia neocortical. Las displasias tisulares son una característica común en el cerebro de los pacientes con epilepsia farmacorresistente, y la extirpación quirúrgica de displasias génicas por convulsiones puede proporcionar un excelente control de las convulsiones15. Por lo tanto, definir el efecto de PING en el tejido cerebral displásico es una prioridad importante. Un modelo de rata de displasia cortical genética…

Discussion

El método PING está diseñado para producir lesiones neuronales dirigidas no invasivas. El método deriva de una base sólida y creciente de investigación en el campo de la ecografía focalizada3,4,5,6,7. La capacidad de proporcionar acceso focal a áreas específicas del parénquima cerebral a través de la apertura transitoria del BBB ha creado una vía p…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores reconocen a Rene Jack Roy por su excelente apoyo técnico en el área de la RMN. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (R01 NS102194 a KSL y R01 CA217953-01 a MW), el Fondo Chester (KSL) y la Fundación de Ultrasonido Focalizado (KSL y JW).

Materials

7T-ClinScan MRI System Bruker Biospin, Ettinglen, Germany MR Image Acquisition
Acoustic Gel Litho CLEAR 11-601 High Viscosity Accoustic Transmission Gel
DPX Mounting Medium Electron Microscopy Sciences 13512 Resin Based Cover Glass Mountant
Fluoro-Jade B EDM Millipore AG310 High Affinity Stain For Degenerating Neurons
Fluovac anesthetic adsorber Harvard Apparatus 34-0388 Organic Anaesthesia Scavenger
FUS System Image Guided Therapy, Pessac, France LabFUS MR Compatible Small Animal Focused Ultrasound System
Gadodiamide GE Healthcare AS, Oslo, Norway Omniscan MR Contrast Agent
Heparin SAGENT NDC2502140010 Anti-Coagulant
Hypodermic needle 30G x 1/2 Becton-Dickinson 26027 Tail Vein Catheterization
Insulin syringe 28G1/2 (1ml) EXEL 26027 Administration of Injectables to Tail Vein Catheter
Isofluorane atomizer SurgiVet VCT302 Anaesthesia Administration
Isoflurane Henry Schein NDC1169567762 Anaesthesia
KMnO4 Sigma 223468 Reagent Used in Fluoro-Jade B Staining
Microbubbles Produced internally: A. Klibanov 305106 Blood Brain Barrier Disrupting Agent
Microbubbles (commercial source) Lantheus Medical Imaging, North Billerica, MA Definity microbubbles Blood Brain Barrier Disrupting Agent
Monitoring & Gating System Small Animal Instruments Model 1030 Respiration Monitoring
Multisizer 3 Coulter counter Beckman-Coulter, Hialeah, FL Multisizer 3 Used to Determine Average Size of Microbubbles
Optixcare EYE LUBE CLC MEDICA, Ontario, Canada 11611 Corneal Protectant-Eye Lube
PE10 tubing Becton-Dickinson 427401 Tail Vein Catheter Component
Quinolinic Acid Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX CAS 89-00-9 Neurotoxin
Sprague-Dawley Rats Taconic Biosciences SD-M Rat Model
Syringe Pump Carnegie Medicin CMA 100 Controlled Delivery of Quinolinic Acid
Thermoguide Software Image Guided Therapy, Pessac, France Thermoguide Drives Lab FUS System
Tish Rats In-house colony Rat Model
Veet depilatory cream Reckitt Benckiser Removal of Scalp Hair

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Citer Cet Article
Wang, W., Zhang, Y., Anzivino, M. J., Bertram, E. H., Woznak, J., Klibanov, A., Dumont, E., Wintermark, M., Lee, K. S. Targeted Neuronal Injury for the Non-Invasive Disconnection of Brain Circuitry. J. Vis. Exp. (163), e61271, doi:10.3791/61271 (2020).

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