Isolamento dei tessuti del sistema nervoso centrale e delle meningi associate per l'analisi a valle delle cellule immunitarie

Il sistema nervoso centrale (SNC) è una sede immunologicamente specializzata. Il parenchima del SNC, escludendo lo spazio del liquido cerebrospinale, le meningi e la vascolarizzazione, è classicamente visto come un sito immuno-privilegiato 1,2,3,4,5 ed è relativamente privo di cellule immunitarie durante le condizioni omeostatiche ^2,6,7. Al contrario, le meningi, che comprendono gli strati dura, aracnoideo e pia, sono componenti cruciali del compartimento del SNC, partecipando attivamente alla sorveglianza immunitaria omeostatica e ai processi infiammatori durante la patogenesi della malattia 3,6,7,8. In condizioni di stato stazionario, le meningi supportano numerose cellule sentinella immunitarie, tra cui le cellule linfoidi innate (ILC), i macrofagi, le cellule dendritiche (DC), i mastociti, le cellule T e, in misura minore, le cellule B 9,10,11.

Le meningi sono strutture altamente vascolarizzate e contengono vasi linfatici che forniscono una connessione linfatica tra il SNC e la sua periferia 8,12,13,14. Nelle condizioni infiammatorie indotte da lesioni del sistema nervoso centrale, infezioni, autoimmunità o persino neurodegenerazione, le cellule immunitarie di derivazione periferica si infiltrano nel parenchima e alterano il paesaggio immunitario all’interno delle meningi. A seguito dell’infiltrazione cellulare, le meningi possono rappresentare una nicchia funzionale per le cellule immunitarie di derivazione periferica, promuovendo l’aggregazione delle cellule immunitarie, l’attivazione delle cellule immunitarie locali e la sopravvivenza a lungo termine nel compartimento del SNC. L’infiammazione meningea prominente si osserva in molteplici malattie che colpiscono il sistema nervoso centrale, tra cui la sclerosi multipla (SM) 15,16,17,18,19, l’ictus 20,21, la lesione sterile 22,23 (cioè lesione del midollo spinale e lesione cerebrale traumatica), l’emicrania 24 e l’infezione microbica ^{25,26,27,28,29}. Pertanto, la caratterizzazione delle cellule residenti e delle cellule immunitarie di derivazione periferica nel compartimento meningeo è essenziale per comprendere il ruolo di queste cellule durante le condizioni di stato stazionario e la patogenesi della malattia.

L’estrazione del cervello, del midollo spinale e delle meningi dal cranio e dai corpi vertebrali è tecnicamente impegnativa e richiede molto tempo. Attualmente non sono disponibili tecniche per l’estrazione rapida del cervello con tutti e tre gli strati meningei intatti. Sebbene la laminectomia produca un’eccellente morfologia del tessuto del midollo spinale e preservi gli strati meningei, è estremamente dispendiosa in termini di tempo e complicata^30,31. Al contrario, i metodi di estrazione più convenzionali come la rimozione del cervello dal cranio e l’estrusione idraulica del midollo spinale facilitano la rapida estrazione del tessuto del SNC, ma sia le meningi aracnoidie che quelle durali vengono perse con queste tecniche^30,31. L’omissione degli strati della dura e dell’aracnoide durante l’isolamento convenzionale dei tessuti cerebrali e del midollo spinale provoca un’analisi incompleta delle cellule all’interno del compartimento del SNC. Pertanto, l’identificazione di nuove tecniche focalizzate sull’estrazione rapida di tessuti del SNC con meningi intatte è fondamentale per l’analisi ottimale del compartimento del SNC.

Questo manoscritto presenta due metodi per l’estrazione rapida del cervello, del midollo spinale e delle meningi dai topi, facilitando l’analisi a valle delle cellule residenti e delle cellule immunitarie derivate perifericamente nel parenchima del SNC e nelle meningi. Questi protocolli ottimizzati si concentrano su 1) l’isolamento di sospensioni a singola cellula per l’analisi a valle e 2) la preparazione del tessuto per l’elaborazione istologica. L’ottenimento di sospensioni unicellulari dal cervello, dal tessuto del midollo spinale e dalle meningi durali e aracnoidee³² consente l’analisi simultanea delle cellule che risiedono sia nel compartimento parenchimale che in quello meningeo. Le sospensioni a singola cellula possono essere utilizzate in diverse applicazioni, tra cui saggi di coltura cellulare per eseguire la stimolazione in vitro 33, immunospot enzimatico (ELISpot)28,34,35, citometria a flusso^36,33 e trascrittomica a singola cellula ³⁷ o bulk. Inoltre, il protocollo ottimizzato per la decalcificazione di interi cervelli e midolli spinali con crani o colonne vertebrali intatti, rispettivamente, consente la decalcificazione delicata dell’osso circostante, lasciando intatte le meningi e preservando la morfologia dei tessuti. Questo metodo consente l’identificazione selettiva di proteine o RNA utilizzando tecniche di immunoistochimica (IHC) o ibridazione in situ (ISH) sia all’interno dello spazio parenchimale che meningeo. La caratterizzazione del fenotipo, dello stato di attivazione e della localizzazione delle cellule residenti e delle cellule immunitarie derivate perifericamente all’interno del SNC può fornire informazioni essenziali per comprendere come i singoli tipi di cellule nel compartimento del SNC contribuiscano all’omeostasi e alla patogenesi della malattia.