Summary

Rotulagem Balística de Neurônios Piramidais em Fatias Cerebrais e na Cultura Celular Primária

Published: April 02, 2020
doi:

Summary

Apresentamos um protocolo para rotular e analisar neurônios piramidais, o que é fundamental para avaliar possíveis alterações morfológicas em neurônios e espinhas dendríticas que podem estar por trás de anormalidades neuroquímicas e comportamentais.

Abstract

Foi relatado que o tamanho e a forma das espinhas dendríticas estão relacionados com sua plasticidade estrutural. Para identificar a estrutura morfológica de neurônios piramidais e espinhos dendrípticos, uma técnica de rotulagem balística pode ser utilizada. No presente protocolo, os neurônios piramidais são rotulados com tintura DilC18(3) e analisados usando software de reconstrução neuronal para avaliar a morfologia neuronal e as espinhas dendríticas. Para investigar a estrutura neuronal, são realizadas análises de ramificação dendríticas e análise de Sholl, permitindo que os pesquisadores desenhem inferências sobre a complexidade de ramificação dendrítica e a complexidade da árvore neuronal, respectivamente. A avaliação das espinhas dendríticas é realizada utilizando-se um algoritmo de classificação assistida automática integral ao software de reconstrução, que classifica as espinhas em quatro categorias (ou seja, fina, cogumelo, stubby, filopodia). Além disso, três parâmetros adicionais (ou seja, comprimento, diâmetro da cabeça e volume) também são escolhidos para avaliar alterações na morfologia da coluna vertebral dendrítica. Para validar o potencial de ampla aplicação da técnica de rotulagem balística, neurônios piramidais da cultura celular in vitro foram rotulados com sucesso. No geral, o método de rotulagem balística é único e útil para visualizar neurônios em diferentes regiões cerebrais em ratos, o que, em combinação com um sofisticado software de reconstrução, permite aos pesquisadores elucidar os possíveis mecanismos subjacentes disfunção neurocognitiva.

Introduction

Em 2000, Gan et al. descreveram uma técnica de rotulagem rápida para neurônios individuais e glia no sistema nervoso que combinava vários corantes lipofílicos, permitindo a rotulagem simultânea de muitas células cerebrais com cores diferentes1,2. Mais recentemente, uma técnica de rotulagem balística foi descrita por Seabold et al.3 que introduziu corantes fluorescentes (Dil) nos neurônios das fatias cerebrais. Uma técnica versátil de coloração, a rotulagem balística é apreciada por sua capacidade de ser utilizada em múltiplas espécies animais e em uma ampla gama de idades. Além disso, pode ser combinado com imunocoloração para identificar subpopulações de células cerebrais3. Em comparação com as técnicas tradicionais (por exemplo, impregnação de prata golgi-cox, microinjeção)4, a rotulagem balística oferece uma oportunidade para distinguir mais claramente características morfológicas, incluindo colunas dendríticas, característica que é fundamental para desenhar inferências sobre complexidade neuronal e conectividade sináptica5.

Neurônios piramidais excitatórios são caracterizados por um único, grande dendrito apical, múltiplos dendritos basais mais curtos, e milhares de espinhas dendríticas6. Neurônios piramidais são encontrados em múltiplas regiões cerebrais relacionadas ao processamento cognitivo de ordem superior, incluindo o córtex pré-frontal (PFC) e o hipocampo. No PFC, os neurônios piramidais são observados nas camadas II/III e camada V, com cada um apresentando morfologia única. Especificamente, os neurônios piramidais na camada II/III do PFC têm um dendrito apical mais curto e menos ramificação do que os neurônios piramidais na camada V6. Dentro do hipocampo, os neurônios piramidais estão localizados nas regiões CA1 e CA3, com cada uma exibindo morfologias distintas. Especificamente, os neurônios piramidais na região ca1 apresentam um dendrito apical mais distinto, com ramificações ocorrendo mais longe do soma, em relação à região ca36.

Espinhos dendréticos em neurônios piramidais tanto no PFC quanto no hipocampo são o local principal das sinapses excitatórias7. As características morfológicas das espinhas dendríticas, que são classicamente caracterizadas em três categorias primárias (ou seja, finas, stubby ou cogumelo8), foram relacionadas com o tamanho da sinapse excitatória9. Espinhos finos, caracterizados por um pescoço longo e fino, cabeça bulbosa pequena e densidades postynapticas menores, são mais instáveis e desenvolvem conexões mais fracas. No entanto, as espinhas de cogumelos, que têm uma cabeça de coluna dendrítica maior, são reconhecidas por formar conexões sinápticas mais fortes, um efeito resultante de seu tamanho maior. Em contraste acentuado, as espinhas stubby são desprovidas de um pescoço de coluna, exibindo uma razão de volume de cabeça e pescoço aproximadamente igual8. Dentro do hipocampo, espinhos ramificados também podem ser observados, pelo qual a coluna vertebral tem múltiplas cabeças que emergem do mesmo pescoço dendrítico10. Portanto, as mudanças morfológicas das espinhas dendríticas poderiam refletir a funcionalidade e a capacidade estrutural. Além disso, estudos têm demonstrado que o tamanho e a forma das espinhas dendríticas estão relacionados à sua plasticidade estrutural, levando à ideia de que pequenas espinhas estão envolvidas na aprendizagem e na atenção, enquanto espinhas maiores e mais estáveis estão envolvidas em processos de longo prazo, incluindo a memória11. Além disso, a distribuição de espinhos dendréticos ao longo do dendrito pode estar associada à conectividade sináptica5,12.

Assim, o presente trabalho metodológico tem três metas: 1) Apresentar nosso protocolo de rotulagem balística, que tem sido utilizado com uma taxa de sucesso (ou seja, neurônios atendendo aos critérios de seleção e apropriados para análise) de 83,3%5,12,13 e em múltiplas regiões cerebrais (ou seja, PFC, núcleo accumbens, hipocampo); 2) Demonstrar a generalização da técnica e sua aplicação aos neurônios cultivados in vitro; 3) Detalhe a metodologia utilizada no software de reconstrução neuronal e as inferências que podem ser extraídas desses dados.

Protocol

Todos os protocolos de animais foram revisados e aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Carolina do Sul (número de garantia federal: D16-00028). 1. Preparação da tubulação de dii/tungstênio Dissolver 100 mg de polivinilpirrolido (PVP) com 10 mL de ddH2O. Vortex a solução PVP levemente. Encha a tubulação com a solução PVP (ver Tabela de Materiais) e deixe-a por 20 min. Em seguida, expulse a solução PVP…

Representative Results

Na Figura 2A,os neurônios piramidais típicos na região hipocampal nas seções cerebrais de ratos foram identificados pela tecnologia de rotulagem balística, caracterizada por um grande dendrito apical e vários dendritos basais menores ao redor do soma. A Figura 2B mostra o neurônio no software de análise quantitativa da reconstrução neuronal após a destécnica, os ramos dendréticos foram rastreados e as espinhas foram detectadas. Posteriormente, os d…

Discussion

Neste protocolo, descrevemos uma técnica de rotulagem versátil para neurônios tanto do cérebro de ratos quanto daqueles cultivados in vitro. Além disso, relatamos a metodologia de utilização do software de reconstrução neuronal e do software de análise quantitativa de reconstrução neuronal para avaliar a morfologia neuronal e as espinhas dendríticas. A avaliação da morfologia neuronal e das espinhas dendríticas fornece uma oportunidade para determinar alterações na complexidade de ramificação dendrít…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi financiado pelas subvenções do NIH HD043680, MH106392, DA013137 e NS100624.

Materials

20Gx25mm PrecisionGlide needle BD 305175
24-well cell culture plate Costar 3562
35 mm Glass Bottom Dishes MatTek Corporation P35G-1.5-20-C
Antibiotic-Antimycotic solution Cellgro 30004CI 100X
B-27 supplement Life Technologies 17504-044 50X
Barrel liner BIO-RAD 165-2417
Borax Sigma B9876
Boric acid Sigma B0252
Cartridge holder BIO-RAD 165-2426
Confocal imaging software Nikon EZ-C1 version 3.81b
Confocal microscope Nikon TE-2000E
Cover glass VWR 637-137
DilC18(3) Fisher Scientific D282
DMEM/F12 medium Life Technologies 10565-018
Dumont #5 Forceps World Precision Instruments 14095
Dumont #7 Forceps World Precision Instruments 14097
F344 rat (Harlan Laboratories, Indianapolis, IN)
Glucose VWR 101174Y
GlutaMax Life Technologies 35050-061 100X
HBSS Sigma H4641 10X
Helios diffusion screens BIO-RAD 165-2475
Helios gene gun kit BIO-RAD 165-2411
Helios gene gun system BIO-RAD 165-2431
Helium hose assembly BIO-RAD 165-2412
Iris Forceps World Precision Instruments 15914
Iris Scissors World Precision Instruments 500216
Methylene chloride Fisher Scientific D150-1
Neurobasal medium Life Technologies 21103-049
Neurolucida 360 software mbf bioscience dendritic spine analysis
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127-500G
Paraformaldehyde Sigma P6148
Poly-L-Lysine Sigma P9155
Polyvinylpyrrolidone Fisher Scientific 5295
ProLong Gold antifade reagent Fisher Scientific P36930 mounting medium
Rat brain matrix, 300 – 600g, Coronal, 0.5mm Ted Pella 15047
Sevoflurane Merritt Veterinary Supply 347075
Sodium Bicarbonate Life Technologies 25080
SuperFrost Plus Slides Fisher Scientific 12-550-154%
Syringe kit BIO-RAD 165-2421
Tefzel tubing BIO-RAD 165-2441
Trypsin-EDTA Life Technologies 15400-054
Tubing cutter BIO-RAD 165-2422
Tubing Prep station BIO-RAD 165-2418
Tungsten M-25 Microcarrier 1.7 µm BIO-RAD 165-2269
Vannas Scissors World Precision Instruments 500086

References

  1. Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Multicolor “DiOlistic” labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations. Neuron. 27, 219-225 (2000).
  2. Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Ballistic delivery of dyes for structural and functional studies of the nervous system. Cold Spring Harbor Protocol. 2009 (4), 5202 (2009).
  3. Seabold, G. K., Daunais, J. B., Rau, A., Grant, K. A., Alvarez, V. A. DiOLISTIC labeling of neurons from rodent and non-human primate brain slices. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
  4. Spacek, J. Dynamics of the Golgi method: a time-lapse study of the early stages of impregnation in single sections. Journal of Neurocytology. 18 (1), 27-38 (1989).
  5. McLaurin, K. A., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. Disruption of Timing: NeuroHIV Progression in the Post-cART Era. Science Reports. 9 (1), 827 (2019).
  6. Spruston, N. Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration. Nature Reviews Neurosciences. 9 (3), 206-221 (2008).
  7. Megias, M., Emri, Z., Freund, T. F., Gulyas, A. I. Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal CA1 pyramidal cells. Neurosciences. 102, 527-540 (2001).
  8. Peters, A., Kaiserman-Abramof, I. R. The small pyramidal neuron of the rat cerebral cortex. The perikaryon, dendrites and spines. American Journal of Anatomy. 127, 321-355 (1970).
  9. Harris, K. M., Sultan, P. Variation in the number, location, and size of synaptic vesicles provides an anatomical basis for the nonuniform probability of release at hippocampal CA1 synapses. Neuropharmacology. 34, 1387-1395 (1995).
  10. Sorra, K. E., Fiala, J. C., Harris, K. M. Critical assessment of the involvement of perforations, spinules, and spine branching in hippocampal synapse formation. Journal of Comparative Neurology. 398, 225-240 (1998).
  11. Mancuso, J. J., Chen, Y., Li, X., Xue, Z., Wong, S. T. C. Methods of dendritic spine detection: from Golgi to high-resolution optical imaging. Neurosciences. 251, 129-140 (2012).
  12. McLaurin, K. A., et al. Synaptic connectivity in medium spiny neurons of the nucleus accumbens: A sex-dependent mechanism underlying apathy in the HIV-1 transgenic rat. Frontiers in Behavior Neurosciences. 12, 285 (2018).
  13. Roscoe, R. F., Mactutus, C. F., Booze, R. M. HIV-1 transgenic female rat: synaptodendritic alterations of medium spiny neurons in the nucleus accumbens. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 9 (5), 642-653 (2014).
  14. Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Booze, R. Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons. Journal of Visualized Experiments. (108), e53697 (2016).
  15. Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. Automated Three-Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic Spines from Fluorescence Microscopy Images. PLoS ONE. 3 (10), 1371 (2008).

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Citer Cet Article
Li, H., McLaurin, K. A., Mactutus, C. F., Booze, R. M. Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture. J. Vis. Exp. (158), e60989, doi:10.3791/60989 (2020).

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