Summary

Ballistische Kennzeichnung von Pyramidal neurons in Gehirnscheiben und in der primären Zellkultur

Published: April 02, 2020
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Summary

Wir präsentieren ein Protokoll zur Kennzeichnung und Analyse pyramidaler Neuronen, das für die Bewertung potenzieller morphologischer Veränderungen in Neuronen und dendritischen Stacheln, die neurochemischen und verhaltensbedingten Anomalien zugrunde liegen können, entscheidend ist.

Abstract

Es wurde berichtet, dass die Größe und Form der dendritischen Stacheln mit ihrer strukturellen Plastizität zusammenhängt. Um die morphologische Struktur von pyramidenförmigen Neuronen und dendritischen Stacheln zu identifizieren, kann eine ballistische Etikettierungstechnik verwendet werden. Im vorliegenden Protokoll werden pyramidale Neuronen mit DilC18(3)-Farbstoff gekennzeichnet und mit neuronaler Rekonstruktionssoftware analysiert, um neuronale Morphologie und dendritische Stacheln zu bewerten. Zur Untersuchung der neuronalen Struktur werden dendritische Verzweigungsanalysen und Sholl-Analysen durchgeführt, die es den Forschern ermöglichen, Rückschlüsse auf die dendritische Verzweigungskomplexität bzw. die neuronale Arbor-Komplexität zu ziehen. Die Auswertung der dendritischen Stacheln erfolgt mit einem automatischen assistierten Klassifizierungsalgorithmus, der zur Rekonstruktionssoftware integriert ist und die Stacheln in vier Kategorien einreibt (d. h. dünn, Pilz, stumpf, filopodia). Darüber hinaus werden weitere drei Parameter (z. B. Länge, Kopfdurchmesser und Volumen) ausgewählt, um Veränderungen in der dendritischen Wirbelsäulenmorphologie zu bewerten. Um das Potenzial einer breiten Anwendung der ballistischen Etikettierungstechnik zu validieren, wurden pyramidale Neuronen aus der In-vitro-Zellkultur erfolgreich gekennzeichnet. Insgesamt ist die ballistische Etikettierungsmethode einzigartig und nützlich für die Visualisierung von Neuronen in verschiedenen Hirnregionen bei Ratten, was es Forschern ermöglicht, die möglichen Mechanismen zu klären, die neurokognitive Dysfunktion.

Introduction

Im Jahr 2000 beschrieben Gan et al. eine schnelle Etikettierungstechnik für einzelne Neuronen und Glia im Nervensystem, die verschiedene lipophile Farbstoffe kombinierte, was die gleichzeitige Kennzeichnung vieler Gehirnzellen mit verschiedenen Farben1,2ermöglichte. In jüngerer Zeit wurde eine ballistische Etikettierungstechnik von Seabold et al.3 beschrieben, die fluoreszierende Farbstoffe (Dil) in die Neuronen von Gehirnscheiben einführte. Eine vielseitige Färbetechnik, ballistische Etikettierung wird für seine Fähigkeit geschätzt, in mehreren Tierarten und über eine breite Palette von Altersgruppen verwendet werden. Darüber hinaus kann es mit Immunostainierung kombiniert werden, um Subpopulationen von Gehirnzellen3zu identifizieren. Im Vergleich zu herkömmlichen Techniken (z. B. Golgi-Cox Silberimprägnierung, Mikroinjektion)4bietet die ballistische Etikettierung die Möglichkeit, morphologische Merkmale, einschließlich dendritischer Stacheln, klarer zu unterscheiden, ein Merkmal, das entscheidend ist, um Rückschlüsse auf neuronale Komplexität und synaptische Konnektivität zu ziehen5.

Exzitatorische pyramidale Neuronen zeichnen sich durch einen einzigen, großen apikalen Dendrit, mehrere kürzere Basaldendriten und Tausende von dendritischen Stacheln6aus. Pyramidale Neuronen sind in mehreren Gehirnregionen im Zusammenhang mit höherer Ordnung kognitive Verarbeitung gefunden, einschließlich der präfrontalen Kortex (PFC) und Hippocampus. In der PFC werden pyramidale Neuronen in den Schichten II/III und Schicht V beobachtet, wobei jede eine einzigartige Morphologie aufweist. Insbesondere pyramidenförmige Neuronen in Schicht II/III der PFC haben einen kürzeren apikalen Dendrit und weniger verzweigt als pyramidale Neuronen in Schicht V6. Innerhalb des Hippocampus befinden sich pyramidale Neuronen sowohl in den CA1- als auch in der CA3-Region, wobei jede unterschiedliche Morphologie zeigt. Insbesondere pyramidenförmige Neuronen in der CA1-Region weisen einen ausgeprägteren apikalen Dendrit auf, wobei verzweigte Verbindungen weiter vom Soma entfernt auftreten, relativ zur CA3-Region6.

Dendritische Stacheln auf pyramidenförmigen Neuronen sowohl im PFC als auch im Hippocampus sind die primäre Stelle für exzitatorische Synapsen7. Morphologische Eigenschaften der dendritischen Stacheln, die klassisch in drei primäre Kategorien (d.h. dünn, stumpf oder Pilz8) charakterisiert sind, wurden mit der Größe der exzitatorischen Synapse9in Verbindung gebracht. Dünne Stacheln, die sich durch einen langen, dünnen Hals, einen kleinen bauchigen Kopf und kleinere postsynaptische Dichten auszeichnen, sind instabiler und entwickeln schwächere Verbindungen. Pilzdornen, die einen größeren dendritischen Wirbelsäulenkopf haben, sind jedoch dafür bekannt, stärkere synaptische Verbindungen zu bilden, ein Effekt, der sich aus ihrer größeren Größe ergibt. Im scharfen Kontrast sind stumpfe Dornen ohne Wirbelsäulenhals, die ein ungefähr gleiches Kopf- und Nackenvolumenverhältnisvon 8aufweisen. Innerhalb des Hippocampus können auch verzweigte Stacheln beobachtet werden, wobei die Wirbelsäule mehrere Köpfe hat, die aus dem gleichen dendritischen Wirbelsäulenhals10hervorgehen. Daher könnten die morphologischen Veränderungen der dendritischen Stacheln Funktionalität und strukturelle Kapazität widerspiegeln. Darüber hinaus haben Studien gezeigt, dass die Größe und Form der dendritischen Stacheln mit ihrer strukturellen Plastizität zusammenhängt, was zu der Idee führt, dass kleine Stacheln am Lernen und an der Aufmerksamkeit beteiligt sind, während größere, stabilere Stacheln an langfristigen Prozessen beteiligt sind, einschließlich Gedächtnis11. Darüber hinaus kann die Verteilung der dendritischen Stacheln entlang des Dendriten mit synaptischen Konnektivität5,12verbunden sein.

So hat das vorliegende methodische Papier drei Ziele: 1) Präsentieren Sie unser Protokoll für die ballistische Kennzeichnung, das mit einer Erfolgsrate (d. h. Neuronen, die Auswahlkriterien erfüllen und für die Analyse geeignet sind) von 83,3%5,12,13 und über mehrere Hirnregionen hinweg (d. h. PFC, Nucleus accumbens, hippocampus) verwendet wurde. 2) Nachweis der Verallgemeinerbarkeit der Technik und ihrer Anwendung auf in vitro angebaute Neuronen; 3) Erläutern Sie die In-Neuronal-Rekonstruktionssoftware verwendete Methodik und die Schlussfolgerungen, die aus solchen Daten gezogen werden können.

Protocol

Alle Tierprotokolle wurden vom Animal Care and Use Committee der University of South Carolina überprüft und genehmigt (Bundesversicherungsnummer: D16-00028). 1. Herstellung von DiI/Tungsten-Perlenschläuchen 100 mg Polyvinylpyrrolidon (PVP) mit 10 ml ddH2O. Vortex die PVP-Lösung leicht auflösen. Füllen Sie den Schlauch mit der PVP-Lösung (siehe Materialtabelle) und lassen Sie ihn 20 min. Dann vertreiben Sie die PVP-Lösung durch das andere …

Representative Results

In Abbildung 2Awurden die typischen pyramidenförmigen Neuronen in der Hippocampusregion in den Hirnabschnitten der Ratte durch ballistische Etikettierungstechnologie identifiziert, die sich durch einen großen apikalen Dendrit und mehrere kleinere Basaldendriten um das Soma auszeichnete. Abbildung 2B zeigt das Neuron in der quantitativen Analysesoftware für die neuronale Rekonstruktion, nachdem das Soma nachgewiesen, dendritische Zweige und Stacheln nachgewies…

Discussion

In diesem Protokoll beschreiben wir eine vielseitige Etikettierungstechnik für Neuronen sowohl aus Rattenhirn als auch für in vitro angebaute. Darüber hinaus berichten wir über die Methodik für die Verwendung von neuronaler Rekonstruktionssoftware und neuronaler Rekonstruktionquantitativer Analysesoftware zur Bewertung der neuronalen Morphologie und dendritischer Stacheln. Die Bewertung der neuronalen Morphologie und dendritischen Stacheln bietet die Möglichkeit, Veränderungen in dendritischer Verzweigungskomplexi…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch NIH-Stipendien HD043680, MH106392, DA013137 und NS100624 finanziert.

Materials

20Gx25mm PrecisionGlide needle BD 305175
24-well cell culture plate Costar 3562
35 mm Glass Bottom Dishes MatTek Corporation P35G-1.5-20-C
Antibiotic-Antimycotic solution Cellgro 30004CI 100X
B-27 supplement Life Technologies 17504-044 50X
Barrel liner BIO-RAD 165-2417
Borax Sigma B9876
Boric acid Sigma B0252
Cartridge holder BIO-RAD 165-2426
Confocal imaging software Nikon EZ-C1 version 3.81b
Confocal microscope Nikon TE-2000E
Cover glass VWR 637-137
DilC18(3) Fisher Scientific D282
DMEM/F12 medium Life Technologies 10565-018
Dumont #5 Forceps World Precision Instruments 14095
Dumont #7 Forceps World Precision Instruments 14097
F344 rat (Harlan Laboratories, Indianapolis, IN)
Glucose VWR 101174Y
GlutaMax Life Technologies 35050-061 100X
HBSS Sigma H4641 10X
Helios diffusion screens BIO-RAD 165-2475
Helios gene gun kit BIO-RAD 165-2411
Helios gene gun system BIO-RAD 165-2431
Helium hose assembly BIO-RAD 165-2412
Iris Forceps World Precision Instruments 15914
Iris Scissors World Precision Instruments 500216
Methylene chloride Fisher Scientific D150-1
Neurobasal medium Life Technologies 21103-049
Neurolucida 360 software mbf bioscience dendritic spine analysis
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127-500G
Paraformaldehyde Sigma P6148
Poly-L-Lysine Sigma P9155
Polyvinylpyrrolidone Fisher Scientific 5295
ProLong Gold antifade reagent Fisher Scientific P36930 mounting medium
Rat brain matrix, 300 – 600g, Coronal, 0.5mm Ted Pella 15047
Sevoflurane Merritt Veterinary Supply 347075
Sodium Bicarbonate Life Technologies 25080
SuperFrost Plus Slides Fisher Scientific 12-550-154%
Syringe kit BIO-RAD 165-2421
Tefzel tubing BIO-RAD 165-2441
Trypsin-EDTA Life Technologies 15400-054
Tubing cutter BIO-RAD 165-2422
Tubing Prep station BIO-RAD 165-2418
Tungsten M-25 Microcarrier 1.7 µm BIO-RAD 165-2269
Vannas Scissors World Precision Instruments 500086

References

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Citer Cet Article
Li, H., McLaurin, K. A., Mactutus, C. F., Booze, R. M. Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture. J. Vis. Exp. (158), e60989, doi:10.3791/60989 (2020).

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