具有蓝色和红移通道性通道性神经元的长距离通道多普辛辅助电路映射

突触连接对神经回路功能至关重要，但神经回路中突触的精确拓扑和生理学往往难以进行实验探讨。这是因为电刺激，传统的细胞电生理学工具，不分青红皂白地激活刺激部位附近的斧子，在大多数大脑区域，来自不同来源的斧子（局部、升序和/或降）交织。然而，通过使用通道多普辛辅助电路映射（CRACM）1^，2，这种限制现在可以克服^3。通道多普辛（ChR2）是一种光激活，阳离子选择性离子通道最初发现在绿色藻原体雷哈德蒂。ChR2可通过波长约为450-490nm的蓝光激活，通过阳离子流入使细胞去极化。ChR2首先由纳格尔及其同事⁴用异种卵母细胞描述和表达。不久之后，Boyden和他的同事⁵在哺乳动物神经元中表达ChR2，并表明他们可以使用光脉冲可靠地控制在毫秒时间尺度上的尖峰，在用蓝光激活ChR2后诱导行动电位+10毫秒。最近发现了具有更快动力学的光遗传学通道（例如，Chronos⁶）。

CRACM实验的基本方法是转染一个假定的预突触神经元群体，该病毒带有一种重组腺相关病毒（rAAV），该病毒携带通道性腺蛋白的遗传信息。具有rAAV的神经元转染导致编码通道性腺蛋白的表达。通常，通道性多普司子被标记有荧光蛋白，如GFP（绿色荧光蛋白）或tdTomato（红色荧光蛋白），以便通过荧光成像可以很容易地确认目标区域神经元的转染。由于rAAV是非致病性的，具有低炎症潜力和持久的基因表达^7，8，它们已成为向神经元提供通道性多普辛的标准技术。如果转染假定的神经元预突触群后，通过光闪烁激活通道性多普辛在目标神经元中引起突触电位或电流，这是从转染细胞核到记录细胞的斧突连接的证据。由于脑切片实验中被切断的斧突可以通过通道性腺素激活来释放神经递质，因此，位于急性切片外部但向脑后脑区域发送斧子的原子核可以通过CRACM识别。该技术的作用是，可以直接研究已识别的远距离突触输入的连接性和生理学。

除了被蓝光兴奋的通道性多普辛外，调查人员最近还发现了几种红移导引性多普辛^9，10，包括Chrimson及其更快的模拟ChrimsonR，两者都因660nm⁶的红光而兴奋。红移蛋白酶是感兴趣的，因为红光穿透组织比蓝光更好，红光可能具有比蓝光^10，11，12更低的细胞毒性。红移通道性多普辛也开辟了双色CRACM实验的可能性，其中来自同一神经元不同核的斧突的收敛可以在一个实验^6，13，14中测试。然而，目前的红移蛋白经常表现出不必要的交叉激活与蓝光15，16，17，使两个颜色实验困难。此外，一些报告指出，ChrimsonR受到有限的斧突贩运，这使得使用ChrimsonR进行CRACM实验^16、17具有挑战性。

几乎所有来自下耳脑干核的上升投影都收敛在下级结体（IC），这是中央听觉通路的中脑中心。这包括从耳蜗核（CN）18，19，大多数优越的橄榄复合物（SOC）20，和背（DNLL）和腹腔（VNLL）核的侧耳核²¹的投影。此外，听觉皮层的大降投影在IC18、19、20、21、22中终止，IC神经元本身在^IC23的局部和反向叶内广泛突触。来自许多来源的斧子的混杂使得使用电刺激²⁴探测IC电路变得困难。因此，尽管IC中的神经元执行对声音定位和语音和其他^{通信声音识别}至关重要的计算，IC中神经回路的组织在很大程度上还是未知的。我们最近确定VIP神经元是^IC27中第一个分子可识别的神经元类别。VIP神经元是谷氨酸硬质质质质的硬质质神经元，投射到几个远程目标，包括听觉丘脑和高级胶质。我们现在能够确定VIP神经元的本地和远距离输入的来源和功能，并确定这些电路连接如何促进声音处理。

此处介绍的协议是专为研究小鼠 IC 中的 VIP 神经元的突触输入而定制的，特别是来自反向 IC 和 DCN 的突触输入（图 1）。该协议可以很容易地适应不同的输入源，不同的神经元类型或完全不同的大脑区域。我们还表明，ChrimsonR 是一种有效的红移通道，用于听觉脑干中的长距离电路映射。然而，我们证明，ChrimsonR被蓝光强激活，即使在低强度下，因此，在双色CRACM实验中，ChrimsonR与Chronos结合，必须使用谨慎的控制来防止ChrimsonR的交叉激活。