Summary

Ein verzögertes Impfmodell der chronischen Pseudomonas aeruginosa Wundinfektion

Published: February 20, 2020
doi:

Summary

Wir beschreiben ein verzögertes Impfprotokoll zur Erzeugung chronischer Wundinfektionen bei immunkompetenten Mäusen.

Abstract

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) ist ein großer nosokomialer Erreger von zunehmender Relevanz für die menschliche Gesundheit und Krankheit, insbesondere bei chronischen Wundinfektionen bei Diabetikern und stationären Patienten. Es besteht ein dringender Bedarf an chronischen Infektionsmodellen, die bei der Untersuchung der Wundpathogenese und der Entwicklung neuer Therapien gegen diesen Erreger helfen. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das eine verzögerte Impfung 24 Stunden nach der exzisionalen Verwundung mit voller Dicke verwendet. Die Infektion der provisorischen Wundmatrix, die zu diesem Zeitpunkt vorhanden ist, versichre entweder eine schnelle Clearance oder Verbreitung von Infektionen und stellt stattdessen eine chronische Infektion fest, die 7–10 Tage dauert, ohne dass Fremdstoffe implantation oder Immunsuppression erforderlich sind. Dieses Protokoll imitiert einen typischen zeitlichen Verlauf einer postoperativen Infektion beim Menschen. Die Verwendung eines lumineszierenden P. aeruginosa-Stamms (PAO1:lux) ermöglicht eine quantitative tägliche Beurteilung der bakteriellen Belastung für P. aeruginosa Wundinfektionen. Dieses neuartige Modell kann ein nützliches Werkzeug bei der Untersuchung der bakteriellen Pathogenese und der Entwicklung neuer Therapien für chronische P. aeruginosa Wundinfektionen sein.

Introduction

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) ist ein gramnegatives, stabförmiges Bakterium mit zunehmender Relevanz für die menschliche Gesundheit und Krankheit. Es ist verantwortlich für eine umfangreiche Morbidität und Mortalität in nosokomialen Umgebungen, insbesondere mit Wundinfektionen bei immungeschwächten Patienten1,2. Das Aufkommen multiresistenter Stämme dieses Erregers hat weitere Impulse für die Untersuchung von Faktoren gegeben, die zur Virulenz von P. aeruginosa, Mechanismen der Antibiotikaresistenz von P. aeruginosa und neuen Methoden zur Vorbeugung und Behandlung dieser tödlichen Infektion beitragen3. Daher war der Bedarf an Tiermodellen chronischer Wundinfektionen als Werkzeuge zur Untersuchung dieser Forschungsfragen noch nie so groß.

Leider neigen viele Tiermodelle der P. aeruginosa-Infektion dazu, eine akute Infektion mit schneller Auflösung der Infektion oder einem schnellen Rückgang aufgrund der Sepsis4,5zu simulieren, was die oft chronische Natur dieser Infektionen nicht ausreichend simuliert. Um diesen Nachteil zu beheben, nutzen einige Modelle die Implantation von Fremdkörpern wie Agarperlen, Silikonimplantaten oder Alginatgelen6,7,8. Andere Modelle verwenden Mäuse, die aufgrund des fortgeschrittenen Alters, Adipositas oder Diabetes immungeschwächt sind, oder durch pharmakologische Mittel wie Cyclophosphamid-induzierte Neutropenie9,10,11,12. Jedoch, entweder die Verwendung von Fremdstoffen oder immungeschwächte Wirte verändert wahrscheinlich den lokalen Entzündungsprozess, so dass es schwierig, ein Verständnis der Pathophysiologie in chronischen Wundinfektionen bei Wirten mit ansonsten normalen Immunsystem beteiligt zu gewinnen.

Wir haben ein chronisches Modell der P. aeruginosa Wundinfektion bei Mäusen entwickelt, das eine verzögerte Impfung mit Bakterien nach exzisionalen Wunden beinhaltet. Verzögerte Impfung ermöglicht Experimente zur Beurteilung der bakteriellen Belastung, die sich auf mindestens 7 Tage ausdehnt. Dieses Modell eröffnet neue Möglichkeiten für die Untersuchung sowohl pathogenese als auch neuer Behandlungen von chronischen Infektionen mit P. aeruginosa.

Protocol

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Stanford University genehmigt. 1. Vorbereitung und Wachstum von Bakterien Führen Sie alle Arbeiten mit P. aeruginosa und Tieren mit BSL-2-Vorkehrungen gemäß den Richtlinien des institutionellen Ausschusses für biosicherheitspolitische Sicherheit und Tierverwendungsausschüsse des Forschers durch. Führen Sie alle hier beschriebenen Schritte mit P. aeruginosa, eins…

Representative Results

Mit einem lumineszierenden PaO1-Stamm mit einem Plasmid, das für das luxABCDE-Reportersystem (PAO1:lux) kodiert, führten wir exzisierende Verwundungen an Mäusen durch, impften diese Wunden mit planktonischem P. aeruginosa 24 h später und maßen die bakterielle Belastung im Laufe der Zeit(Abbildung 1 und Abbildung 2). Ein repräsentatives Bild, das mit einem optischen Bildsystem gewonnen wurde, zeigt, dass dieses Mode…

Discussion

Wir haben ein neuartiges Modell für die verzögerte Impfung P. aeruginosa Wundinfektion entwickelt. Die Strategie, die Impfung mit Bakterien nach exzissiver Verwundung um 24 stunden zu verzögern, ermöglicht die Bewertung von Wundinfektionen über einen Zeitraum von einer Woche. Durch die Verwendung eines lumineszierenden Stammes von P. aeruginosaist es möglich, das Infektionsverlauf während des Infektionsverlaufs zu verfolgen. Der längere Infektionsverlauf im Vergleich zu anderen P. aeruginosa…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Der pUT-Tn5-EM7-lux-Km1 Leuchtkonstruktvektor war ein gnädiges Geschenk von J. Hardy. Schemata wurden mit BioRender.com erstellt. Wir danken dem Labor von G. Gurtner für ihre Ratschläge zum Wundinfektionsmodell. Wir danken auch T. Doyle vom Stanford Center for Innovation in In Vivo Imaging für sein technisches Know-how. Diese Arbeit wurde durch Stipendien R21AI133370, R21AI133240, R01AI12492093 und Stipendien von Stanford SPARK, dem Falk Medical Research Trust und der Cystic Fibrosis Foundation (CFF) an P.L.B. C.R.D unterstützt, die von T32AI007502 unterstützt wurde. Ein Gabilan Stanford Graduate Fellowship for Science and Engineering und ein Lubert Stryer Bio-X Stanford Interdisciplinary Graduate Fellowship unterstützten J.M.S.

Materials

0.9% Sodium Chloride injection Hospira 2484457
18 G x 1 sterile needle BD 305195
25 G x 1 1/5 sterile needle BD 305127
Alcohol swab BD 326895
Aura Imaging Software Spectral Instruments Imaging n/a
Betadine Purdue Frederick Company 19-065534
Buprenorphine SR LAB Zoopharm n/a
C57BL/6J male mice The Jackson Laboratory 000664
Disposable biopsy punch, 6mm Integra 33-36
Fine scissors – Tungsten Carbide Fine Science Tools 14568-09
Glass Bead Dry Sterilizer Harvard Apparatus 61-0183
Granulated Agar Fisher BioReagents BP9744
Heating Pad Milliard 804879481218
Insulin syringe with 28 G needle BD 329461
Lago X Imaging System Spectral Instruments Imaging n/a
LB broth Fisher BioReagents BP1426
Leur-Lok 1 mL syringe BD 309628
Mini Arco Animal Trimmer Wahl Professional 919152
Nair Hair Removal Lotion with Baby Oil Church and Dwight n/a Available at any pharmacy
Octagon Forceps Fine Science Tools 11041-08
Petri dish Falcon 351029
Phosphate Buffered Saline (PBS) 1x Corning 21-040-CV
Press and Seal Cling Wrap Glad n/a
SafetyGlide Insulin syringe with 30 G needle BD 305934
Safetyglide Insulin syringe, 1/2 mL, 30 G x 5/16 TW BD 305934
Scale Ohaus Scout Pro SP202
Supplical Nutritional Supplement Henry Schein Animal Health 29908
Tegaderm, 6 cm x 7 cm 3M 1624W

References

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Citer Cet Article
de Vries, C. R., Sweere, J. M., Ishak, H., Sunkari, V., Bach, M. S., Liu, D., Manasherob, R., Bollyky, P. L. A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection. J. Vis. Exp. (156), e60599, doi:10.3791/60599 (2020).

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