Separación del sobre celular para bacterias gramnegativas en fracciones de membrana interna y externa con ajustes técnicos para Acinetobacter baumannii

Las bacterias gramnegativas producen dos membranas que están separadas por un espacio periférico y una pared celular de peptidoglycan¹. La membrana interna (IM) encierra el citosol y es una bicapa simétrica de fosfolípidos. Peptidoglycan protege contra la presión del turgencia y proporciona a la bacteria una forma celular, y está unido a la membrana externa (OM) por lipoproteínas^2,,3. El OM rodea la periferia y es predominantemente asimétrico. El prospecto interno se compone de fosfolípidos y el prospecto externo consiste en glucólidos conocidos como lipooligosacáridos (LOS) o lipopolisacáridos (LPS)^4,5. La asimetría lipídica y la bioquímica de las moléculas LOS/LPS en el prospecto exterior confieren propiedades de barrera a la superficie celular que protegen la bacteria contra los peligros en su entorno^6,7.

Las moléculas de LPS se componen de tres componentes: el disacárido lipídico A, el oligosacárido central y el o-polisacárido u antígeno O. El lípido A es un disacárido acilado multiplicado. Los oligosacáridos de núcleo consisten en 10-15 azúcares conocidos como LPS áspero sordos o R-LPS. El núcleo se subdivide en la región interna, compuesto por ácido 2-keto-3-deoxy-D-manno-octulosonic (kdo) y uno o más residuos de heptosa, y una región externa que consiste generalmente de hexosis (glucosa o galactosa) y heptoses, o azúcares acetamido⁵. La región del núcleo exterior es más variable en sus componentes y estructura que el núcleo interno. En Salmonella spp., sólo se ha descrito una estructura central; sin embargo, en Escherichia coli hay cinco estructuras centrales diferentes (designadas K-12, R1, R2, R3 y R4)⁸. E. coli K-12 DH5, que utilizamos en este procedimiento lleva una mutación que resulta en la producción R-LPS⁹. Las moléculas R-LPS carecen de la mitad del antígeno O y tienen un peso molecular similar a las moléculas LOS.

La adición de antígeno O a R-LPS convierte esta molécula en LPS liso, o S-LPS. Los antígenos O se construyen a partir de subunidades cortas de carbohidratos de 3-4 y consisten en múltiples modalidades con diferentes longitudes de cadena^10. Algunas bacterias productoras de LPS, como Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), muestran una distribución trimodal de moléculas LPS en su superficie^10,11. Los antígenos O de cadena muy larga pueden contener más de cien subunidades y pesar más de cien kilodaltones. Los antígenos O proporcionan propiedades superficiales a la bacteria que son necesarias para resistir los antibióticos, evadir la depredación por bacteriófagos y causar enfermedades.

Las especies de Campylobacter, Bordetella, Acinetobacter, Haemophilus, Neisseria y otras generan moléculas LOS en lugar de moléculas LPS en su superficie^12. Las moléculas LOS consisten en lípidos A y oligosacáridos centrales, pero carecen del antígeno O. Estos tipos de bacterias Gram-negativas modifican sus oligosacáridos principales con azúcares adicionales y combinaciones de azúcares para alterar las propiedades superficiales^12. Tanto los microbios productores de LOS como los LPS derivan los fosfatos en el lípido A y las moléculas centrales con mitades catiónicas^7. Estas adiciones incluyen sustituciones de fosfoetanolamina, galactosamina y aminoarabinosa, que funcionan neutralizando la carga superficial aniónica y protegiendo así contra los péptidos antimicrobianos catiónicos. Las bacterias gramnegativas también modifican la estructura del oligosacárido central con sustituciones variables no estequiométricas de azúcares, o moléculas de kdo adicionales, y alteran el número de cadenas de acil en los disanolípidos lípidos-A⁷.

La capacidad de aislar el IM del OM de las bacterias Gram-negativas ha sido fundamental para entender el papel de la envoltura celular en la resistencia a los antimicrobianos y la patogénesis de la enfermedad^11,12. Las derivaciones de este enfoque se han utilizado para deducir mecanismos de montaje, mantenimiento y remodelación de la proteína, fosfolípidos y componentes glucólidos para el OM.

Nuestro laboratorio realiza rutinariamente análisis lipidomicos bacterianos para estudiar la regulación de lípidos mediada por proteínas y la función de lípidos en una variedad de especies Gram-negativas. Los volúmenes utilizados en el protocolo reflejan el uso rutinario de este procedimiento para analizar fosfolípidos no radiomarcados mediante cromatografía de capa delgada y cromatografía líquida espectrometría de masas en tándem^13,14.

El protocolo comienza exponiendo una suspensión refrigerada de bacterias Gram-negativas a una solución osmolar alta de sacarosa y añadiendo lisozyme para disociar el OM de la capa subyacente de peptidoglycan(Figura 1)¹². EDTA se añade entonces para facilitar la penetración de la lisozyme, ya que el secuestro de cationes divalentes interrumpe las interacciones de puente electrostático lateral entre las moléculas adyacentes los PÉRDIDA/LPS¹⁵. El protocolo original del que se ha adaptado el nuestro requería la formación de esferoplastias, una forma celular bacteriana Gram-negativa que consiste en una membrana plasmática y citosol, pero carece de la capa de peptidoglicano y un OM. Es posible que las esferoplastias se produzcan por el método adaptado; sin embargo, la técnica no se basa ni pretende su formación para el éxito. En su lugar, las bacterias tratadas con lisozyme-EDTA se cosechan rápidamente por centrifugación y se vuelven a suspender en una solución de sacarosa de menor concentración antes de la lisis presurizada. Los oMs que podrían haber sido liberados mediante la formación de esferoplastias deberían, en teoría, ser cosechables de los sobrenadores de las células tratadas, pero este enfoque no se detalla en este documento. En última instancia, las células tratadas se someten a homogeneización y lisis convencionales, lo que mejora la eficiencia y reproducibilidad del procedimiento de separación de^{membranas 16}.

Después de la lisis, las membranas totales se recogen por ultracentrifugación y se aplican a un gradiente discontinuo de densidad de sacarosa para fraccionar los MN y oMs. El enfoque clásico utiliza un gradiente más continuo que consiste en al menos cinco soluciones de sacarosa diferentes^11,12. El gradiente discontinuo de nuestro protocolo consta de tres soluciones de sacarosa y divide las bicapas en dos fracciones diferenciadas^17. Las moléculas LOS y LPS dentro de los OMs de las bacterias Gram-negativas impulsan la envolvente a dividirse en una fracción IM de baja densidad marrón superior y una fracción OM de alta densidad blanca inferior(Figura 1 y Figura 2).

Acinetobacter baumannii son importantes patógenos humanos multirresistentes que producen moléculas LOS en su OM y erigen una envoltura celular que es difícil de separar^18,,19. Los trabajos recientes sugieren que una derivación del protocolo que presentamos aquí se puede utilizar para dividir las bicapas de estos organismos²⁰. Por lo tanto, probamos nuestro protocolo en A. baumannii 17978. Inicialmente, el procedimiento era inadecuado. Sin embargo, modificamos la concentración de sacarosa de la solución de densidad media y mejoramos en gran medida la separación(Figura 2). Se utilizó un ensayo de deshidrogenasa NADH y un procedimiento de extracción y detección de LOS/LPS para confirmar la separación de A. baumannii,tipo salvaje S. Typhimurium y dos genotipos enterobacterianos con deficiencia de o-antígeno; a saber, galE-mutant S. Typhimurium y una cepa de laboratorio, E. coli DH5 (Figura 3 y Figura 4).

La intención de este trabajo es proporcionar un enfoque simplificado para aislar reproduciblemente las membranas de las bacterias Gram-negativas. El protocolo se puede utilizar para estudiar muchos tipos de moléculas asociadas a la membrana para estos microbios.